基于生物信息學分析急性心肌梗死基因表達差異及中藥干預

楊顯娟，王立映，王 建，王佳俊，付 尹，李金秀，肖琳萱

急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)是心肌急性缺血性壞死，致死率極高的一種冠心病類型，具有發病急、并發癥多的特點[1]。據流行病學調查研究[2]，35歲以下臨床AMI患者數量逐年增多。臨床對AMI采用早期再灌注治療、優化藥物和干細胞治療干預心室重構(ventricular remodeling，VR)，雖有一定治療效果，但也存在不良反應[3]。中藥防治疾病具有多靶點、多途徑的特點。現有研究[4]也證實中藥可改善心肌梗死后VR。因此，深入探究AMI的發生發展機制,中藥干預潛在機制和藥物新發現具有重要意義。該研究利用GEO數據庫，通過生物信息學手段和分析方法，深入挖掘AMI的關鍵基因，將關鍵基因與中藥進行映射，得到潛在的基因治療靶點和藥物，為AMI的分子機制和治療藥物實驗研究提供新思路和理論依據。

1 材料與方法

1.1 微陣列數據來源以“Acute myocardial infarction”為關鍵詞，在基因表達數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中搜索，共檢索到435篇關于人類AMI系列的文章，選擇下載GSE66360基因表達譜。GSE66360基因表達數據集是基于GPL570平臺([HG-U133_Plus_2] Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array)，所有數據均可在線獲得。

1.2 數據預處理和差異基因的篩選GEO2R(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/)是GEO數據庫提供的一個基于R語言的在線分析程序，檢測正常人與AMI患者之間的DEGs。為保證數據集的完整性與可比性，對芯片數據進行背景校正、標準化和log2轉換處理，使用GraphPad Prism 8.0繪制火山圖對質量控制后的數據進行可視化。以校正的P(adj.P)<0.05及|log2FC| ≥1為標準篩選出差異基因，其中log2FC≥1代表基因表達上調，log2FC ≤-1代表基因表達下調。

1.3 DEGs功能分析及通路富集分析GO是一個重要的生物信息數據庫，可分別從細胞組分、生物過程和分子功能3個層面進行功能注釋。KEGG是公認的信號通路系統性分析數據庫。本研究中DEGs的GO分析和KEGG通路富集分析是基于Metascape平臺(http://metascape.org/gp/index.html)在線可視化基因注釋系統數據庫進行的，P<0.01為差異有統計學意義。

1.4 DEGs蛋白-蛋白相互作用(PPI)網絡構建及關鍵基因分析將DEGs輸入STRING(https://string-db.org/)數據庫進行蛋白-蛋白相互作用(protein-proteininteraction，PPI)分析，選取得分大于0.9的基因輸入Cytoscape軟件進行可視化。應用軟件中的CytoHubba插件計算每個蛋白質節點的程度，節點degree越高，在網絡中的生物學功能越多。根據degree算出排名前10的基因被鑒定為關鍵基因。

1.5 靶點對接與中藥預測利用Coremine Medical(https://coremine.com/medical/#search)與篩選出的關鍵基因進行相互映射，篩選出關鍵基因相關的治療中藥，以P<0.01為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 DEGs芯片數據質量控制使用GEO2R(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/)對GSE66360芯片數據進行預處理，GSE66360數據預處理后中位數位于同一水平線，表明芯片數據質量較好，平行實驗的均一性良好，可用于正常和心肌梗死患者差異表達基因的后續分析。見圖1。

圖1 樣本芯片數據均一化處理箱線圖藍色盒子：正常樣本；紅色盒子：心肌梗死樣本

2.2 差異基因GSE66360包括50例正常樣本和49例心肌梗死樣本。根據P(adj.P)<0.05及|log2FC| ≥1標準篩選，GSE66360篩選出943個差異基因，包括711個上調基因和232個下調基因。進一步采用火山圖和熱圖對該數據進行可視化處理。見圖2、3。

圖2 差異表達基因的火山圖綠色點：表達量下調的基因；紅色點：表達量上調的基因；黑色的點：正常表達的基因

圖3 GSE66360差異基因聚類熱圖

2.3 DEGs GO富集分析和KEGG信號通路分析使用Metascape對DEGs進行GO和KEGG信號通路富集分析。GO分析顯示其BP主要集中在髓樣白細胞活化、細胞因子產生的調節、白細胞趨化性等方面；細胞組成主要集中在分泌顆粒腔、膜面、膜的外在成分等；分子功能主要表現在趨化因子受體結合、模式識別受體活性、細胞因子結合等。KEGG 信號通路富集分析顯示主要參與的信號通路有腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)、缺氧誘導因子1(hypoxia inducible factor-1，HIF-1)和JAK-STAT信號通路等，見圖4～7。

圖4 DEGs基因KEGG分析A：Osteoclast differentiation；b：TNF signaling pathway；c：Leishmaniasis；d：Cytokine-cytokine receptor interaction；e：AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications；f：Transcriptional misregulation in cancer；g：Viral carcinogenesis；h：Complement and coagulation cascades；i：MAPK signaling pathway；j：Hepatitis B；k：Measles；l：Jak-STAT signaling pathway；m：Pathways in cancer；n：Bladder cancer；o：Apoptosis；p：FoxO signaling pathway；q：HIF-1 signaling pathway；r：Ferroptosis；s：B cell receptor signaling pathway；t：Fc gamma R-mediated phagocytosis

圖5 DEGs基因BP分析A: myeloid leukocyte activation；b：response to bacterium；c：regulation of cytokine production；d：cytokine-mediated signaling pathway；e：leukocyte chemotaxis；f：lymphocyte activation；g：positive regulation of cell death；h：positive regulation of cell migration；i：immune response-regulating signaling pathway；j：fat cell differentiation；k：regulation of inflammatory response；l：regulation of DNA-binding transcription factor activity；m：macrophage activation；n：blood vessel morphogenesis；o：lipopolysaccharide-mediated signaling pathway；p：apoptotic signaling pathway；q：response to steroid hormone；r：negative regulation of immune system process；s：cellular response to interleukin-1；t：positive regulation of cytokine biosynthetic process

圖6 DEGs基因CC分析A: tertiary granule；b：ficolin-1-rich granule；c：secretory granule lumen；d：side of membrane；e：vacuole；f：endocytic vesicle membrane；g：extracellular matrix；h：platelet alpha granule；i：clathrin-coated endocytic vesicle membrane；j：membrane microdomain；k：anchored component of membrane；l：cell body；m：early endosome；n：I-kappaB/NF-kappaB complex；o：extrinsic component of membrane；p：fibrinogen complex；q：nuclear pore；r：Golgi membrane；s：endoplasmic reticulum-Golgi intermediate compartment；t：transcription factor complex

圖7 DEGs基因MF分析A：chemokine receptor binding；b：pattern recognition receptor activity；c：immunoglobulin binding；d：cytokine binding；e：carbohydrate binding；f：RNA polymerase II proximal promoter sequence-specific DNA binding；g：RAGE receptor binding；h：CCR5 chemokine receptor binding；i：SMAD binding；j：pantetheine hydrolase activity；k：1-acylglycerol-3-phosphate O-acyltransferase activity；l：peptide binding；m：glucocorticoid receptor binding；n：nucleoside binding；o：extracellular matrix structural constituent；p：CXCR chemokine receptor binding；q：growth factor receptor binding；r：phosphatidylinositol 3-kinase regulator activity；s：lipid binding；t：protein tyrosine phosphatase activity

2.4 PPI網絡的構建及關鍵基因分析利用Cytoscape軟件對差異基因進行PPI網絡分析(圖8)，并通過插件CytoHubba篩選degree排名前10的基因，定義其為關鍵基因(FPR2、STAT3、CXCL1、CXCL8、UBR4、JUN、PTAFR、FCER1G、GPR84、PLAU)，結果如圖9、表1所示。

表1 關鍵基因

圖8 差異基因蛋白質-蛋白質互作網絡

圖9 關鍵基因的蛋白互作網絡

2.5 靶點對接篩選預測中藥將10個關鍵基因映射到Coremine Medical數據庫，篩選出干預AMI的潛在中藥，P<0.05為差異有統計學意義，由于Coremine Medical數據庫缺少UBR4信息。因此，未預測該基因映射的潛在治療中藥。結果顯示，FPR2映射出中藥蜈蚣(P=0.003 30)；STAT3映射出中藥百花蛇舌草(P=0.002 00)、黃絲郁金(P=0.002 39)、姜黃(P=0.002 40)、重樓(P=0.002 48)、丹參(P=0.002 72)、茵陳(P=0.004 92)等；CXCL1映射出中藥蟛蜞菊(P=0.003 54)；CXCL8映射出中藥平貝母(P=0.003 71)、山慈姑(P=0.003 95)、黃絲郁金(P=0.005 31)、姜黃(P=0.005 35)、安息香(P=0.021 90)等；JUN映射出中藥人參(P=0.001 59)、川木通(P=0.002 20)、五味子(P=0.002 42)、三七(P=0.024 40)等；PTAFR映射出中藥白果(P=0.002 87)、銀杏葉(P=0.002 89)；PLAU映射出中藥靈芝(P=0.003 02)、地膽草(P=0.005 15)、穿山龍(P=0.006 15)、益智(P=0.007 84)、地龍(P=0.008 58)；FCER1G和GPR84無滿足條件中藥，其中出現頻次最高的是黃絲郁金和姜黃兩味中藥，這些中藥可能通過調控其相互映射的靶點發揮對AMI干預作用的潛在藥物來源。

3 討論

AMI患者與健康人基因表達存在差異，利用生物信息學方法，從GEO數據庫下載AMI基因芯片分析表明，與正常健康人相比，AMI患者中共有DEGs 943個。對其進行KEGG信號通路和功能富集分析發現，參與的信號通路主要有TNF、HIF-1和JAK-STAT信號通路等，這些信號通路都與心梗后病程的發生發展密不可分。如TNF信號通路，既對促進細胞凋亡、細胞骨架重構、產生血栓等方面產生影響，又對促進細胞存活和分化以及免疫和炎癥反應發揮作用。

預測出的中藥大多分布在活血化瘀藥、補虛藥、清熱藥、利水滲濕藥、化痰藥、息風止痙藥、祛風濕止痛藥和開竅藥。因一藥具有多種功效，故分類是相對的，其間亦有交叉，如郁金、川木通等亦能清心除煩；地龍、蜈蚣長于通經活絡。

活血化瘀藥丹參主治胸痹心痛、脘腹脅痛等。研究[5]表明丹參具有改善心肌缺血，促進心肌損傷恢復，縮小心肌梗死范圍等的藥理保護作用。實驗研究[6]顯示丹參注射液能夠顯著減輕AMI患者經皮冠狀動脈介入治療術后血管內皮細胞氧化應激損傷,保護缺血再灌注心肌功能,改善預后。郁金可治心血瘀阻之胸痹心痛，常與丹參、瓜蔞等配伍使用。郁金的主要化學成分姜黃素通過抑制細胞凋亡和自噬發揮對H9c2心肌細胞缺氧/復氧損傷的保護作用[7]。姜黃可用治氣滯血瘀之胸痹心痛證。姜黃的主要化學成分姜黃素能明顯降低大鼠心肌梗死心肌內活性氧、丙二醛的表達量；增高大鼠心肌梗死心肌內p-AKT/AKT表達，發揮心肌梗死后減慢心肌損傷的保護作用[8]。

清熱藥白花蛇舌草灌注離體蟾蜍心臟時心率明顯減慢，心肌收縮力明顯減弱，說明白花蛇舌草具有負性心肌作用[9]，重樓所含的重樓皂苷Ⅰ可減輕大鼠心肌I/R損傷[10]，但對于心肌梗死缺血/再灌注的研究與應用仍相對薄弱。黃芩的主要活性成分黃芩素可通過調節JAK/STAT信號通路發揮對心肌缺血/再灌注損傷的保護作用[11]。止咳平喘藥白果的主要成分白果內酯經血小板活化因子受體發揮對大鼠心臟的抗缺血效應[12]。平貝母、山慈姑、茵陳、蜈蚣等中藥在心肌疾病中則鮮見報道。補虛藥如人參具有抗休克、強心、抗缺氧、保護心肌和改善血液流變學等藥理作用。息風止痙藥地龍具有抗心律失常、改善微循環的藥理作用。劉靜[13]研究發現在西藥規范治療的基礎上聯合復方地龍片可以有效改善氣虛血瘀型不穩定性心絞痛患者的臨床心絞痛發作及相關中醫癥狀,且安全性良好。開竅藥安息香可用于中風痰厥、中惡昏迷、心腹疼痛。安息香可與其他辛香走竄類藥物配伍使用，宣通心竅，散痹消結，利氣止痛[14]。陳鐸葆 等[15]研究表明神香蘇合丸可對抗垂體后葉素引起的心肌缺血動物ST-T抬高，明顯緩解實驗性大鼠心肌缺血。

傳統中藥具有多功效、多成分、多靶點、多途徑的特點，應用范圍廣，且不良反應小。在治療AMI疾病中得到廣泛的應用與研究。本研究表現出對以上藥物的深化與佐證。預測的中藥類型較為豐富，部分中藥已廣泛運用于臨床或實驗性研究，某些中藥卻鮮見報道、臨床運用也較少，其對AMI干預作用的藥用價值究竟如何還需進一步探索，為尋找新藥提供了新思路。