網絡藥理學分析及實驗驗證銀丹心腦通保護MIRI的作用機制

徐啟麗，鄒常超，莫麗莉，周海燕,劉興德,

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(coronary heart disease，CHD),簡稱冠心病，是危害人類健康、造成中國人疾病負擔的主要疾病之一，且發病率呈逐年上升趨勢[1-2]。隨著再灌注治療的不斷發展，CHD患者的病死率下降，遠期預后得到明顯改善，然而心肌再灌注引起的心律失常、無復流、心肌細胞凋亡等，對患者的預后有著深遠的影響。臨床研究表明[3-5]，銀丹心腦通可以降低冠心病患者心絞痛發作頻率、心絞痛持續時間，改善慢性心力衰竭患者心功能，降低心血管事件發生率。然而目前對該藥治療心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)8的藥理機制研究較少，該研究旨在利用網絡藥理學方法探討該作用機制，為銀丹心腦通軟膠囊(Yindan Xinnaotong soft capsules，YD)應用于臨床應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 網絡藥理學檢索下列數據庫：TCMSP數據庫(http://tcmspw.com/tcmsp.php)，中國知網(http://search.chkd.cnki.net)，SwissTargetPrediction數據庫(http://www. swisstargetprediction.ch/)，Uniprot數據庫(https://www.uniprot.org/)，GeneCards數據庫(https://www.genecards.org/)，STRING數據庫(https://string-db.org/)，Metascape數據庫(https://metascape.org/)；使用下列軟件：Cytoscape3.7.2軟件，R3.6.0軟件，微生信在線作圖軟件(http://www.bioinformatics.com.cn/)，Autodock 2.5.0，Autodock vina 1.1.2，Pymol開源版等。

1.2 細胞實驗人心肌AC-16細胞株購自美國模式培養物研究所(ATCC)。胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素混合液、DMEM-basic(1×)培養液、胰蛋白酶(美國Gibco公司)；銀丹心腦通軟膠囊(貴州百靈企業集團制藥股份有限公司)；DMSO(美國Sigma公司)；細胞增殖與毒性檢測試劑盒CCK-8(日本同仁化學研究所)；乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)；蛋白印跡相關試劑均購自北京索萊寶科技有限公司；抗體：AKT1、p-AKT1、p-STAT3多克隆抗體(美國CST公司),PI3K(美國abcam公司),STAT3多克隆抗體(沈陽萬類生物科技有限公司),GAPDH多克隆抗體、二抗山羊抗兔二抗(武漢三鷹生物技術有限公司)。

1.3 方法

1.3.1網絡藥理學

1.3.1.1化學成分的收集 在CNKI數據庫上對YD的藥物組成及相關活性物質進行搜集，通過TCMSP數據庫進行ADME參數設置(OB≥30%且 DL≥0.18 )，篩選出符合條件的活性物質作為活性成分。

1.3.1.2靶點的預測篩選及中藥活性成分-靶點網絡構建 將篩選得到的活性成分導入Swiss Target Prediction，物種選擇為“人類”(Homo sapiens)，進行靶標預測。利用 UniProt 數據庫對靶點處理，得到靶基因的標準名稱。利用GeneCards數據庫對“心肌缺血再灌注損傷”(myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)進行疾病靶點篩選。然后，將得到的藥物活性成分相關靶點與疾病靶點取交集，重合的靶點即為YD活性成分作用于MIRI的相關靶點。

1.3.1.3靶點蛋白相互作網絡構建及關鍵靶點篩選 利用STRING在線數據庫對靶點的蛋白間相互作用(protein protein interaction,PPI)進行分析。將靶點信息導入STRING數據庫，物種選擇“Homo sapiens”，將蛋白互作綜合得分>0.7 作為篩選條件從而得到靶點的PPI信息，將得到的PPI信息導入 Cytoscape 軟件，得到 PPI 網絡圖可視化。

1.3.1.4靶點基因本體論(gene ontology,GO)和KEGG通路富集分析 Metascape數據庫中提交交集靶集點，進行GO和KEGG富集分析。

1.3.1.5分子對接驗證 從Pubchem下載活性成分結構式，保存為*mol2格式，利用pymol轉換為*pdb格式；從PDB數據庫下載蛋白3D結構*pdb格式。利用Auto dock進行加氫、計算電荷等處理，保存為pdbqt文件，并用Autodock Vina進行小分子與蛋白對接，將對接結果導入Pymol進行分子對接做圖。

1.3.2細胞實驗

1.3.2.1細胞培養 取對數期生長良好的AC-16細胞，種植在加有10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素混合液的DMEM中,于37 ℃、提供5% CO2飽和濕度細胞培養箱中培養。

1.3.2.2低氧/復氧模型構建 收集對數期生長良好的AC-16細胞種植在培養板中，于37 ℃、5% CO2、95%的新鮮空氣培養箱中培養。貼壁后將進行低氧處理的AC-16細胞更換為不含有胎牛血清的培養液。按預定分組進行加藥，需進行低氧處理的AC-16細胞于含有1% O2、94% N2、5% CO2缺氧培養箱中孵育24 h后，將細胞放置在37 ℃，含有5% CO2、95%新鮮空氣培養箱中培養4 h。進行下一步檢測。

1.3.2.3CCK-8比色法檢測細胞活力 收集AC-16細胞調整細胞密度為1×105個/ml，按每孔100 μl細胞懸液接接種到96孔板中，培養過夜。按照不同濃度的YD進行分組：0、50、200、400 mg/L，復孔5個/組，每組均設置不加細胞的空白組進行對照，以消除藥物本身的顏色對吸光度的影響。加藥后按照1.3.2.2中方法進行缺氧，待細胞復氧結束后，在每孔中加入10 μl CCK-8溶液，37 ℃孵育2 h，酶標儀檢測OD值。細胞活力=[(實驗孔-空白孔)]/[(對照孔-空白孔)]。選取細胞活力最強的藥物濃度進行后續實驗。

1.3.2.4乳酸脫氫酶(LDH)滲漏檢測 將細胞分成低氧/復氧組(H/R組)、低氧/復氧+銀丹心腦通組(H/R+YD組)，細胞復氧結束后，收集細胞培養液上清液，按照試劑盒中檢測步驟，進行LDH滲漏檢測。

1.3.2.5Western blot檢測蛋白表達 將AC-16細胞分成對照組(Control組)、銀丹心腦通組(YD組)、H/R組、H/R+YD組。低氧復氧處理結束后，吸去培養液，裂解液充分裂解后，轉移至1.5 ml EP管中，4 ℃離心，14 000 r/min，20 min。將蛋白上清液轉移至新的EP管中，BCA法檢測蛋白濃度。按比例加入5×Loading buffer，100 ℃煮沸10 min。每孔取40 μg蛋白進行聚丙烯胺凝膠電泳，轉膜結束后用質量分數為5%的脫脂牛奶封閉1 h，一抗孵育過夜，次日二抗孵育1 h，Bio-Rad成像儀顯影成像，Image Lab軟件進行灰度分析。

2 結果

2.1 YD的活性成分篩選利用TCMSP 數據庫對YD所含成分進行檢索。其中，山楂、艾片未檢索到相關結果，大蒜未篩選到符合ADME參數的成分，通過文獻檢索獲取這3味藥的有效成分，并將其納入統計；根據ADME參數對余下的6味藥物進行篩選。去重后共得到YD 105個活性成分，其中銀杏20個，丹參48個，絞股藍10個，細辛11個，三七8個，大蒜4個；山楂5個，艾片4個。見表1。

表1 藥物-成分-靶點統計

2.2 潛在靶點的預測取每個活性成分在Swiss Target Prediction數據庫中得到的預測靶點的前15名，去重后共得到藥物靶點382個。從GeneCards數據庫中得到“MIRI”疾病靶點1 223個，藥物-疾病共同靶點160個。見圖1。其中包括TNF、MAKP、IL-2、IL-6、MMP、PPAR、PIK3等。

圖1 YD與MIRI靶點韋恩圖

2.3 活性成分-靶點網絡分析利用Cytoscape軟件構建YD藥物-成分-疾病-靶點的相互作用網絡，該網絡含有485個節點，1 822個化合物-靶標關系。其中有95個化合物可同15個及以上的靶點相互連接，推測這些化合物可能是YD的主要活性成分藥效物質基礎，其中排名前30的活性成分。見表2。有46個靶蛋白可同10個及以上的活性成分產生相互作用。見表3。

表2 度值(degree)排名前30的活性化合物

表3 能與10個及以上的活性成分相關聯的基因

2.4 YD治療MIRI的PPI網絡構建通過在STRING數據庫中錄入藥物-疾病共同靶點，選擇綜合得分大于0.7的靶點，并去掉獨立于網絡外的靶點，得到的PPI網絡關系數據導Cytoscape軟件進行可視化分析，構建PPI網絡關系圖。見圖2。在該網絡關系圖中，包含139個節點和725個關系，大于平均度值8的靶點共70個，其中包括AKT1、HSP90、MAPK8、BCL2-L1、IL2等。根據度值(degree)、中介中心性(betweenness)、接近中心性(closeness)分別篩選出前10名的基因，去重后得到13個關鍵靶點，分別是AKT1、STAT3、VEGFA、TNF、MAPK8、PIK3CA、F2、PPARA、APP、PTGS2、SRC、ESR1、HSP90AA1。推測YD可能通過這些靶點發揮抗MIRI作用。見表4。

圖2 YD治療MIRI的PPI網絡

表4 PPI網絡中Top的靶點

2.5 靶點通路富集分析將160個共同靶點導入Metascape數據庫中進行GO分析，設置Pvalue≤0.01,得到的分析結果，分別取前10名導入微生信在線作圖軟件繪制富集分析圖。KEGG分析主要與TRP通道的炎性介質調節、脂肪細胞脂解調節、PPAR信號通路、流體剪應力與動脈粥樣硬化、血小板活化、鈣信號通路等相關。生物過程(biological process,BP)主要與細胞對氮化合物的反應、肌肉細胞增殖、細胞因子介導的炎癥反應、氧化應激、細胞凋亡、脂溶反應等密切相關。細胞組成(cellular component,CC)主要涉及膜筏、細胞器外膜、內體管腔、膜的外在成分、血小板α顆粒、質膜蛋白復合物、溶酶體管腔、受體復合物等。分子功能(molecular function,MF)主要富集為生長因子受體結合、肽結合、激素受體結合、蛋白酶結合、內肽酶活性、蛋白磷酸酶結合、蛋白酪氨酸激酶活性、胰島素受體底物結合、氧化還原酶活性結合等。見圖3、4。

圖3 GO生物學過程分析、細胞組分分析、生物功能分析

圖4 KEGG富集分析

2.6 核心成分的分子對接驗證將YD度值排名前3的化合物與PPI網絡中排名前6的靶點進行分子對接驗證。通常認為結合能<-5 kcal/mol提示兩者可以結合，<-7 kcal/mol提示兩者有較好的結合能力。結果顯示，AKT1、STAT3、VEGFA、APP、MAPK8、PIK3CA均能與槲皮素、木犀草素、山柰酚結合。其中VEGFA、APP、PIK3CA能與主要成分較好的結合。見表5和圖5。

圖5 分子對接圖A-D：STAT3和木犀草素對接模式；E：VEGFA和木犀草素對接模式；F：PIK3CA和山萘酚對接模式

表5 蛋白與小分子結合能(kcal/mol)

2.7 YD對H/R損傷誘導的AC-16細胞活力的影響通過CCK-8比色法分析在H/R損傷誘導下，暴露于不同濃度YD的AC-16細胞系的細胞活力。結果表明，200 mg/L的劑量可增加H/R損傷誘導的AC-16細胞的細胞活力(P<0.000 1),見圖6A。 因此，將增加AC-16細胞活力的200 mg/L YD用于以下實驗。

2.8 YD對H/R損傷誘導的AC-16細胞的LDH滲漏的影響檢測LDH含量以評估細胞膜的完整性。結果表明，200 mg/L的YD能減少H/R損傷誘導的AC-16細胞的LDH滲漏，P<0.05。見圖6B。

圖6 YD對H/R損傷誘導的AC-16細胞活力、LDH滲漏的影響A:不同濃度YD對H/R損傷誘導的AC-16細胞的活力的影響；B:200 mg/L的YD對H/R損傷誘導的AC-16細胞LDH滲漏的影響；3：H/R組；4：H/R+YD組；與0 mg/L組比較：&P<0.05；與50 mg/L組比較：ΔP<0.05；與3組相比：#P<0.05

2.9 YD對H/R損傷誘導的AC-16細胞增殖的影響光鏡觀察YD對H/R損傷的AC-16細胞的增殖情況的影響。結果顯示，與對照組相比，H/R損傷明顯抑制細胞增殖，200 mg/L的YD可減輕這一現象。見圖7。

圖7 YD對H/R損傷誘導的AC-16細胞增殖的影響 ×100A:Control組；B:YD組；C:H/R組；D:H/R+YD組

2.10 YD對AC-16細胞STAT3、p-STAT3、PI3K、AKT1、p-AKT1蛋白表達的影響結果顯示，在無H/R誘導情況下，加藥組STAT3表達較未加藥組降低；H/R誘導后，H/R損傷可導致STAT3水平降低，加藥組與未加藥組未見明顯差異，見圖8B。在無H/R誘導的情況下，加藥組對STAT3磷酸化水平無明顯影響，H/R損傷可以刺激STAT3磷酸化，在H/R誘導情況下，YD可以促進STAT3磷酸化水平,見圖8C。在無H/R損傷誘導情況下，加藥組與未加藥組未見明顯差異；H/R誘導可抑制Akt1磷酸化水平，200 mg/L YD能逆轉這一現象，促進p-Akt1表達,見圖8D。在無H/R誘導情況下，加藥組PI3K表達增加；H/R誘導后，加藥組PI3K表達明顯降低；200 mg/L YD能逆轉這一現象，促進PI3K表達,見圖8E。

圖8 YD對AC-16細胞STAT3、p-STAT3、PI3K、Akt1、p-Akt1蛋白表達的影響A:Western blot檢測各組細胞蛋白表達水平；B:STAT3蛋白表達水平；C:p-STAT3蛋白表達水平；D:PI3K蛋白表達水平；E:p-Akt1蛋白表達水平；1:control組；2:YD組；3：H/R組；4：H/R+YD組；與Control組比較：*P<0.05；與H/R組比較：#P<0.05

3 討論

MIRI是CHD病理生理過程中加重心肌組織進一步損傷的重要機制。再灌注期間，大量氧自由基生成引起氧化應激反應，白細胞激活，釋放大量促炎因子，導致心肌缺血缺氧損傷進一步加重。YD應用于臨床多年，療效安全確定，然而目前對該藥的藥理作用研究報告甚少，為了探究YD治療MIRI的藥理機制，該研究通過TCMSP數據庫和文獻檢索對其主要活性成分篩選，匹配出對應基因，再與疾病基因映射，最終得到該藥物作用于MIRI的關鍵靶點和通路。

雖然在TCMSP 數據庫中沒有篩選出大蒜和艾片的活性成分，但大量文獻資料報道了大蒜及艾片治療心血管疾病藥效明確。艾片具有抗炎、抗氧化作用[6]，藥理學研究表明，艾片對改善大鼠急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)藥效明顯優于天然冰片和合成冰片，且無明顯量效關系[7]。大蒜辣素能抑制心肌梗死后大鼠的心肌纖維化[8],大蒜素可以抑制自噬，減輕心肌肥大，抑制心室重塑[9]；蒜氨酸具有調節血脂和抗氧化的作用[10]。因此該研究增加了艾片中的4種活性成分以及大蒜中的大蒜素、大蒜精油、蒜氨酸和大蒜辣素。而在藥物-靶點網絡中也證實艾片中的α-蒎烯和左旋龍腦與核心靶點中的細胞色素P450c17α(CYP17A1)相互映射。

對PPI網絡中篩選得到的重要靶標進行分析。其中度值位居第一的Akt1是影響心肌細胞活性與功能的主要決定因素之一，激活Akt1可以調控下游的因子影響細胞的增殖、凋亡、自噬等過程[11]；傳導與轉錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)在多種心血管疾病的病理生理過程中發揮重要調節作用。研究[12]表明，激活STAT3可降低心肌梗塞大鼠模型的梗塞面積。該研究中表明，YD能減輕H/R誘導的AC-16心肌細胞損傷，增加細胞活力，減少LDH滲漏。其機制與PI3K-AKT1和STAT3信號通路有關。

對160個共同靶點進行富集分析顯示，YD主要通過流體剪應力與動脈粥樣硬化、TRP通道的炎性介質調節、脂肪細胞脂解調節、血小板活化、鈣信號通路、PPAR受體信號通路發揮抗MIRI的作用。流體剪應力能與TNF-α協同作用，促進內皮細胞自噬，加速內皮細胞的脫落[13]，加快AS的進程。鈣信號通路參與心肌細胞的增殖、凋亡過程,調節鈣信號通能減輕細胞內鈣超載，保護心肌缺血再灌注損傷[14]。過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferators-activated receptors，PPARs)參與脂質氧化和細胞增殖過程，激動PPAR信號通路能使caspase蛋白表達下調,保護心肌細胞[15]。

綜上所述，YD治療MIRI是多成分-多靶點-多通路協同作用的結果。該研究從多個角度對其潛在作用靶點及分子機制進行預測，并從細胞水平、蛋白水平進行驗證，為后續實驗提供新的探索思路，也為該藥物應用于臨床提供理論依據。