甘草甜素對小鼠矽肺纖維化的干預作用

張 靜，郭一銘，李恩紅，趙萌萌，賈佳佳，郝小惠,2，郭靈麗,2，劉和亮,2

矽肺是由于勞動者在生產環境中長期吸入大量含游離二氧化硅粉塵引起的以矽結節形成和彌漫性纖維化為主要病理改變的一種職業性疾病。目前矽肺尚無有效的治療方法。甘草甜素作為甘草中的重要活性成分，在抗炎、抗腫瘤以及免疫調節等方面發揮重要作用，可以減少炎癥因子的釋放，對實驗性肝纖維化[1]、腎纖維化[2]以及特發性肺纖維化[3]等纖維化疾病具有治療作用，但有關甘草甜素在矽肺纖維化中的作用尚不明確。該研究構建小鼠矽肺模型并給予甘草甜素干預，通過肺功能檢測、組織病理學觀察以及分子生物學等手段，探究甘草甜素在小鼠矽肺纖維化中的作用，為矽肺的預防及治療提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物無特定病原體級C57BL/6雄性小鼠18只(北京維通利華實驗動物技術有限公司)，6～8周齡，體質量20～25 g。飼養條件：溫度23 ℃，相對濕度45%～50%，晝夜替換12 h，自主飲水及進食。適應性喂養1周后用于實驗。該研究經華北理工大學實驗動物倫理委員會審查批準(批號：2016037)。

1.2 儀器和試劑FinePointe WBP全身體積描記系統購自美國Buxco公司；多功能酶標儀購自美國Molecular Device公司；實時熒光定量PCR儀購自美國賽默飛公司；二氧化硅購自美國Sigma公司；甘草甜素購自美國Selleck生物科技有限公司；水合氯醛購自天津市大茂化學試劑廠；甲醛溶液購自天津市津東天正精細化學試劑廠；伊紅、蘇木精染液購自珠海貝索生物技術有限公司；0.05%天狼星紅飽和苦味酸染色液購自河北瑞帕特生物科技有限公司；羥脯胺酸含量測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所；TRIzol購自美國AB & Invitrogen公司；逆轉錄、熒光定量PCR試劑盒購自日本Takara公司；引物合成由上海生工生物工程股份有限公司完成；轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)ELISA試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.3 動物分組與處理采用隨機數字表法將小鼠分為對照組、矽肺模型組以及甘草甜素治療組，6只/組。采用滴鼻法進行造模，連續4 d向矽肺模型組和甘草甜素治療組小鼠鼻腔中滴注0.05 ml 二氧化硅懸液(100 mg/ml)。自造模前一天起每天給予甘草甜素腹腔注射[劑量為50 mg/(kg·d)]，而對照組和模型組小鼠給予腹腔注射等體積0.9%氯化鈉溶液。造模后第28天使用FinePointe WBP全身體積描記系統對小鼠肺功能進行測量，于次日將其處死。

1.4 小鼠肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)中總細胞計數腹腔注射體積分數為4%的水合氯醛溶液(100 g/ml)麻醉小鼠，采用頸椎脫臼法處死小鼠，將其固定于操作板上。在小鼠頸部正中位置切開1 cm的小口，鈍性分離組織并暴露氣管，給予氣管插管。使用止血鉗夾住右側肺葉，對小鼠左肺進行PBS溶液灌洗0.5 ml×3次。收集BALF于1.5 ml離心管中，在4 ℃ 1 000 r/min條件下離心6 min，吸出上清液分裝凍存于-80 ℃，隨后向細胞沉淀加入0.1 ml PBS溶液進行重懸，在顯微鏡下對細胞懸液進行細胞計數。

1.5 小鼠肺組織病理學檢查使用體積分數為10%的甲醛溶液固定小鼠肺組織標本24 h，經常規脫水、石蠟包埋、切片分別進行HE染色和天狼星紅染色，最后于光學顯微鏡下觀察。

1.6 小鼠肺組織羥脯氨酸含量的測定準確稱取30 mg肺組織，冰上剪碎，向其中加入1 ml水解液，混勻。在95 ℃條件下水浴20 min，使用雙蒸水定容至10 ml。吸取4 ml稀釋的水解液向其中加入適量活性炭，在3 500 r/min條件下離心10 min。最后吸取1 ml上清液在550 nm條件下測量各孔的吸光度值。按照說明書中提供的公式進行計算，得到小鼠肺組織羥脯氨酸的含量。

1.7 小鼠肺組織中單核細胞趨化蛋白-1(monocyte chemotactic protein 1，MCP-1)、纖連蛋白(fibronectin，FN)和α-平滑肌肌動蛋白(alpha-smooth muscle actin，α-SMΑ)mRNA的測定使用TRIzol法提取小鼠肺組織總RNA，測定RNA濃度及純度后根據逆轉錄試劑盒說明書將RNA逆轉錄為cDNA，最后根據實時熒光定量PCR試劑盒說明書進行檢測。采用Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System進行擴增。擴增條件：95 ℃、30 s，95 ℃、5 s，60 ℃、30 s，共42個循環。選取GAPDH作為內參基因，按照2-ΔΔCt法計算各基因的相對表達量。引物名稱及序列表見表1。

表1 引物名稱及序列

1.8 小鼠BALF中TGF-β1含量的測定根據小鼠TGF-β1 ELISA試劑盒說明書進行操作并使用酶標儀在波長450 nm條件下測量各孔的吸光度值。按照說明書中提供的公式進行計算，得出各組小鼠BALF中TGF-β1的水平。

2 結果

2.1 HE染色結果對照組小鼠肺組織結構正常，肺泡結構完整，無炎性細胞的聚集。與對照組相比，矽肺模型組小鼠肺組織結構破壞，肺泡間隔斷裂，肺泡壁增厚，出現大量炎性細胞聚集并伴有纖維化樣改變。而甘草甜素治療組小鼠肺組織較矽肺模型組病變程度較輕。見圖1。

圖1 小鼠肺組織HE染色結果 ×200A：對照組；B：矽肺模型組；C：甘草甜素治療組

2.2 天狼星紅染色結果對照組小鼠肺組織中肺泡結構完整，間質未見膠原沉積，而矽肺模型組小鼠肺組織膠原分布明顯增多。與矽肺模型組相比，甘草甜素治療組小鼠肺間質膠原沉積明顯減少。見圖2。

圖2 各組小鼠肺組織天狼星紅染色 ×200A：對照組；B：矽肺模型組；C：甘草甜素治療組

2.3 小鼠肺功能檢測結果與對照組相比，矽肺模型組小鼠呼吸暫停(pause, PAU)和氣道狹窄指數(enhanced pause，Penh)顯著升高。與矽肺模型組相比，甘草甜素治療組小鼠的PAU和Penh顯著降低，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組小鼠肺功能檢測結果

2.4 肺組織羥脯氨酸含量三組小鼠肺組織中羥脯氨酸含量差異有統計學意義(F=13.310，P<0.05)。與對照組相比，矽肺模型組小鼠肺組織羥脯氨酸含量顯著增加。而與矽肺模型組相比，甘草甜素治療組小鼠羥脯氨酸含量顯著降低，差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖3A。

2.5 肺組織MCP-1、FN和α-SMA mRNA的表達三組小鼠肺組織中MCP-1、FN和α-SMA mRNA的表達差異有統計學意義(F=5.282，P<0.05；F=18.047，P<0.05；F=15.916，P<0.05)。其中，矽肺模型組小鼠肺組織中MCP-1、FN和α-SMA mRNA的表達高于對照組；甘草甜素治療組小鼠肺組織中MCP-1、FN和α-SMA mRNA的表達低于矽肺模型組，差異均有統計學意義。見圖3B。

圖3 甘草甜素對小鼠肺組織羥脯氨酸含量及MCP-1、FN和α-SMA mRNA表達的影響A：各組小鼠肺組織中羥脯氨酸含量；B：各組小鼠肺組織MCP-1、FN和α-SMA mRNA的表達；與對照組比較：*P<0.05；與矽肺模型組比較：#P<0.05

2.6 小鼠BALF中總細胞數和TGF-β1的含量矽肺模型組小鼠BALF中總細胞數高于對照組，而甘草甜素治療組小鼠BALF中總細胞數低于矽肺模型組。此外，矽肺模型組小鼠BALF中TGF-β1含量高于對照組，而甘草甜素治療組小鼠BALF中TGF-β1含量低于矽肺模型組，且差異均有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 各組小鼠BALF中總細胞數和TGF-β1含量

3 討論

矽肺病是我國最常見、最嚴重的職業病之一[4]，嚴重者可導致肺組織結構的破壞甚至導致患者肺功能的損害[5]。甘草甜素是甘草酸及其鹽類的統稱，是一種具有抗炎、抗病毒、抗腫瘤作用的天然活性物質。該研究表明甘草甜素可以減少矽肺小鼠肺組織的炎癥水平，降低纖維化程度，改善矽肺小鼠的肺功能。

當二氧化硅粉塵經呼吸道進入肺部，將會被巨噬細胞吞噬，刺激機體引發炎性級聯反應。其中MCP-1作為一種趨化因子，可以激活單核巨噬細胞促進細胞因子的產生，參與炎癥反應[6]。當肺組織反復受到刺激時，成纖維細胞會異常增殖并伴有膠原纖維的合成，進而促進纖維化病灶的產生。FN和α-SMA是纖維化過程中兩個關鍵蛋白，它們參與細胞外基質的合成[7-9]。該研究通過實時熒光定量PCR分別檢測MCP-1、FN和α-SMA mRNA水平，結果顯示模型組小鼠肺組織中MCP-1、FN和α-SMA mRNA表達高于對照組，經甘草甜素治療后降低。提示甘草甜素具有一定的抗矽肺纖維化作用。

TGF-β1是一個經典的促纖維化因子，可以促進細胞的增殖、分化、遷移，參與免疫調節，誘導成纖維細胞向肌成纖維細胞分化[10]，促進組織修復和纖維化的生成[11]。有研究[12-13]顯示，矽肺患者血清和BALF中TGF-β1的表達升高，抑制TGF-β1可以抑制矽肺的發展。研究[3]表明，甘草甜素可以抑制博來霉素誘導的肺纖維化小鼠肺組織中TGF-β1/Smad2/3信號通路的活性。

綜上所述，小鼠在經甘草甜素治療后，BALF中TGF-β1的表達顯著降低。提示甘草甜素可能通過作用TGF-β1相關信號通路參與調節矽肺纖維化,但其機制尚待進一步研究。