新疆維吾爾族T2DM患者外周血circRNA差異表達初步研究

仝夢維，常向云

糖尿病(diabetes mellitus， DM)是一組以高血糖為特征的代謝性疾病。根據國際糖尿病聯盟(international diabetes federation，IDF)報告顯示全球DM患病人數逐年升高；其中2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus ，T2DM)患者約占90%[1]。T2DM長期可累積損害心、腦、腎等器官，嚴重影響患者的生活質量。近年研究提示一不具有5′端帽子和3′端多聚A尾的非編碼RNA，由外顯子、內含子或者外顯子和內含子共同構成[2]，并且大量存在[3]。環狀RNA(circular RNA，circRNA)具有組織特異性及發育特異性、進化保守性、較高的抗外切酶或核糖核酸酶降解的特點[4-5]，這些特性可更好地輔助研究疾病的發生機制及提高有關疾病的預防和診療水平。多項研究[6-8]表明，circRNA參與了糖尿病及其并發癥的發生發展過程。多次流行病學調查顯示新疆地區維吾爾族T2DM的患病率遠高于同地區其他民族，并且其并發癥檢出率也較高[9]。該研究通過高通量核苷酸測序技術篩選出維吾爾族T2DM患者差異表達的circRNAs，選取其中4條，經擴大人群樣本量觀察其在外周血中的表達情況，探討這些circRNAs在維吾爾族T2DM分子生物學發病機制方面的意義。

1 材料與方法

1.1 研究對象入組樣本來自石河子大學醫學院第一附屬醫院2019年10月—2020年6月門診體檢者及住院患者的外周靜脈血。該研究經石河子大學醫學院第一附屬醫院倫理委員會批準(批號：2018-028-01)；并征得所有研究對象的知情同意，進入研究之前均簽署知情同意書。所有入組人員均接受過75 g口服葡萄糖耐量試驗(OGTT試驗)。T2DM診斷均符合1999年WHO的糖尿病診斷標準[10]，余納入標準：① 長期居住新疆，三代內未與其他民族通婚的維吾爾族；② 無自身免疫性疾病，無嚴重的心、肝、腎臟疾病，無惡性腫瘤，非妊娠、哺乳期婦女；③ 年齡均大于40歲。最初的“高通量核苷酸測序隊列”由5例明確診斷的維吾爾族T2DM患者和5例維吾爾族正常對照者(NC組)組成，而驗證隊列由22例明確診斷為T2DM患者和20例NC組成。其中，T2DM組平均年齡(62.10±11.23)歲，男9例，女13例；NC組平均年齡(56.95±9.72)歲， 男9例，女11例。見表1。

表1 入組對象基本信息

1.2 單核細胞提取入組的研究對象均要求夜00：00以后禁食，以確保空腹8 h以上，于次日晨抽取外周靜脈血5 ml，置于EDTA抗凝管中；根據外周血單核細胞提取試劑盒(TBD公司，天津)說明將試劑與外周血形成濃度梯度后置于水平離心機中以2 500 r/min離心20 min，收集離心后的單核細胞，加入TRIzol，-80 ℃冰箱保存。

1.3 總RNA的提取以及質量和完整性檢測按照TRIzol試劑盒(美國Invitrogen公司)說明書，提取外周血單核細胞的總RNA；用紫外分光光度儀(Nanodrop ND-2000，美國Thermo公司)測定總RNA的濃度和純度，要求A260/A280在1.8 ～2.0之間；用變性瓊脂糖凝膠電泳法測定總RNA的完整性。見圖1。

圖1 RNA電泳圖

1.4 差異環狀RNA篩選采用Findcirc(武漢生命之美科技有限公司)進行轉錄組高通量測序，預測出來的circRNA中滿足長度大于10 000 bp，且back spliced reads數目大于2的進行基因組定位分析。通過樣本聚類關系判斷測序實驗設計及樣本取材的正確性，表達值由顏色刻度表示，強度從藍色(相關系數越低)增至紅色(相關系數越高)；如樣本相似性越高，相似系數越大，聚類分析熱圖越接近紅色，樣本類聚關系越近。見圖2。根據各樣本中的circRNA表達情況進行兩樣本間的相關性分析，以此來檢查不同樣品之間的circRNA表達水平的相關性。采用edgeR軟件進行數據標準化和差異性表達的circRNA篩選，當表達變化倍數(fold change，FC)≥2.0或≤0.5，P<0.05時表示有顯著差異性，通過MA Plot(縱坐標表示以10為底取log值的表達量變化差異的統計學顯著性(以10為底取log值)，橫坐標表示以2為底取log值表達量變化倍數(以2為底取log值)。上調circRNAs位于上方的藍色線條(M value=1,FC=2)以上部分，下調circRNAs位于下方的藍色線條(M value=1,FC=0.5)以下部分。分層聚類分析產生熱圖[每一列表示一個組織樣本，每一行表示1個circRNA，表達值由顏色刻度表示，強度從藍色(相對低表達)增至紅色(相對高表達)]，以顯示NC和T2DM外周血之間的表達上調和下調的circRNAs。

圖2 樣本聚類圖

1.5 反轉錄及RT-qPCR采用Thermo(美國)反轉錄試劑盒：20 μl反應液體系：Templet RNA 8 μl，Oligo(dT) primer 1 μl， 5×Reaction Buffer 4 μl, RiboLock RNnase Inhibitor 1 μl，10 mmol/L Dntp Mix 2 μl，RevertAid M-MuLV RT(200 U/μl) 1 μl， RNase-free water 2 μl；反轉錄合成第一鏈cDNA，條件：42 ℃ 60 min，70 ℃ 5 min。circRNAs雙向引物由引物設計軟件Blast設計，交由上海吉瑪合成。RT-qPCR采用的QuantiNova SYBR-Green PCR Kit(500)，20 μl反應液體系(德國 Qiagen GmbH)：2×SYBR-Green PCR Master Mix 10 μl，QN ROX Reference Dye 0.5 μl，CircRNA引物1 μl， 第一鏈cDNA 2 μl， RNase-free water 6.5 μl。在實時定量PCR儀(美國應用生物系統公司7500 Fast Real-Ttime PCR System)上進行擴增，反應條件為:95 ℃、5 min，40個PCR循環[95 ℃、10 s，60 ℃、30 s(收集熒光)]，為建立PCR產物的熔解曲線，擴增反應結束后，95 ℃、15 s，60 ℃、60 s，95 ℃、15 s，60 ℃、15 s，從60 ℃緩慢加熱至99 ℃(儀器自動進行Ramp Rate為0.05 ℃/s)。反應結束由系統自動計算各反應管Ct值，采用2-ΔΔCt法進行相對定量。所有樣本定量PCR反應均為1式3孔。PCR擴增曲線基線平滑，指數擴增期明顯，直到平臺期，副孔之間平行性較好，說明PCR擴增良好；熔解曲線為單峰，無雜峰，說明擴增產物具有特異性，無其他非特異性產物存在。見表2。

表2 用于分析circRNA 水平的RT-qPCR 引物

2 結果

2.1 高通量核苷酸測序結果本次高通量核苷酸測序共發現134個差異表達的circRNAs，其中87個表達上調，47個表達下調，見圖3。這些差異表達的circRNAs大多數由外顯子構成，見圖4；并且分布于各個染色體，包括X染色體，見圖5。通過MA Plot過濾，最終確定兩組間差異有統計學意義的circRNAs，見圖6，并根據以下兩個基本參數(FC≥2或≤0.5，P<0. 05)選定目標circRNAs進行qRT-PCR實驗；經篩選和比對挑選出符合標準的4個circRNAs，其中表達上調：hsa-circ-0139634(FC=3.365，P=0.009)，has-circ-0005414(FC=3.343，P=0.006)；表達下調：hsa-circ-0032491(FC=3.456，P=0.044)，hsa-circ-0002922(FC=3.690，P=0.013)。見表3。

圖3 NC和T2DM外周血微陣列分析熱圖

圖4 根據基因組起源對顯著失調的circRNAs 進行分類

圖5 染色體中環狀RNA分布

表3 四個顯著失調的circRNAs

圖6 NC與T2DM的外周血circRNAs的差異表達的MA plot

2.2 RT-qPCR驗證候選circRNA及ROC曲線分析本研究選取T2DM患者(n=22)及NC人外周血(n=20)進一步驗證。通過RT-qPCR技術實時繪制熔解曲線及擴增曲線，最終結果顯示，擴增曲線基線平滑且熔解曲線為單峰，其中hsa-circ-0139634(P<0.001)、hsa-circ-0032491(P=0.029)及has-circ-0002922(P=0.040)在2組人群中差異表達具有統計學意義，與測序結果一致；has-circ-0005414(P=0.910)在2組人群中的差異表達未得到驗證，見表4。分別對4個circRNAs進行ROC曲線分析顯示，hsa-circ-0139634的ROC曲線下面積是0.926[95%CI(0.839～1.000)，P<0.001], 約登指數為0.833，敏感性為1.000，特異性為0.833，截斷值為0.169；has-circ-0005414的ROC曲線下面積是0.575[95%CI(0.370～0.779)，P=0.910], 約登指數為0.278，敏感性為0.412，特異性為0.867，截斷值為5.749；hsa-circ-0032491的ROC曲線下面積是0.316[95%CI(0.086～0.440)，P=0.017]， 約登指數為0.056，敏感性為1.000，特異性為0.056，截斷值為0.230；hsa-circ-0002922的ROC曲線下面積是0.263[95%CI(0.078～0.428)，P=0.014]， 約登指數為0.080，敏感性為0.955，特異性為0.125，截斷值為0.011，見圖7。

表4 兩組間RT-qPCR驗證的基因情況[M(P25，P75)]

圖7 所選定的4條circRNA的ROC曲線A：has-circ-0005414基因；B：hsa-circ-0139634基因；C：has-circ-0032491基因；D：has-circ-0002922基因

3 討論

T2DM在全球是一個比較普遍的代謝性疾病，其發病機制尚不清楚，僅知其由環境因素和遺傳因素聯合作用所致。維吾爾族是T2DM的高發病率人群，該研究為首次探索新疆維吾爾族T2DM患者外周血中circRNAs的差異表達譜及其在維吾爾族T2DM分子生物學發病機制方面的意義。該研究運用高通量核苷酸測序技術對維吾爾族5例T2DM者和5例NC的志愿者樣本進行了測序，獲得了兩組間circRNAs差異表達譜，差異表達的circRNAs分布于各個染色體上；通過MA plot過濾發現這些差異表達circRNAs中的大部分在維吾爾族T2DM組中是上調表達的，其中外顯子占比為86%。根據基因hsa-circ-0139634、has-circ-0005414、hsa-circ-0032491及has-circ-0002922的序列設計出用于RT-qPCR驗證的雙向引物，通過42例樣本檢測了4個circRNAs的表達量，結果顯示hsa-circ-0139634、hsa-circ-0032491、has-circ-0002922在兩組人群中的差異表達具有統計學意義。查閱近幾年關于circRNAs與DM發生有關的國內外文章，未見關于hsa-circ-0139634、hsa-circ-0032491、has-circ-0002922與DM相關聯的報道。本次實驗是首次提出hsa-circ-0139634、hsa-circ-0032491、has-circ-0002922在維吾爾族T2DM患者與NC人群中的表達量存在差異性。通過對hsa-circ-0139634、hsa-circ-0032491、has-circ-0002922進行ROC曲線下面積分析，顯示hsa-circ-0139634的曲線下面積最大，且其靈敏度、特異性及正確指數均較高，推測其在維吾爾族T2DM分子生物學發病機制方面具有潛在價值，可能成為區分維吾爾族T2DM患者與NC人群的新型分子標志物。

目前研究者[11]認為circRNAs主要通過以下四種方式發揮作用：① 作為micro RNA(miRNA)海綿，通過吸附miRNAs抑制其翻譯功能；② 少部分circRNAs可作為翻譯模板，翻譯出對應蛋白質；③ 與蛋白質相結合并抑制蛋白質的作用；④ 可調節親本基因參與轉錄，其中以作為miRNA海綿的作用最為重要，這是一種通過內源性競爭作用來調節miRNA靶基因的轉錄。如環狀RNA CIRS-7/CDR1as能夠通過阻斷miR-7及其下游通路，調節胰島細胞胰島素的轉錄和分泌；環狀RNA circHIPK3可通過隔離miR-124-3p和miR-338-3p以及調節β細胞關鍵基因如Slc2a2、Akt1和Mtpn的表達而干擾胰島細胞的功能[12]。因此，推測此次測序發現的差異表達的circRNAs可能是通過miRNA海綿作用對下游靶基因產生調節，從而影響維吾爾族T2DM的發生發展。

目前研究還沒有確鑿的證據證明hsa-circ-0139634的功能；因此，hsa-circ-0139634與miRNA的相互作用機制將是后期深入研究的內容。該研究是單一中心的研究，受試者在地理上高度集中，尚不清楚其他地區和民族是否也有類似的circRNAs表達譜，因此該研究結果需要在更多樣化的隊列中進一步驗證；并且該研究為小樣本研究，未在大樣本中進一步驗證，因此課題組將在后期研究中對該研究的circRNAs進行大樣本驗證及對應通路預測和驗證。該研究為探索維吾爾族T2DM的分子生物學發病機制打下了前期基礎，為維吾爾族T2DM患者的診療帶來新思路。