NRAGE對結直腸癌細胞增殖和侵襲能力的作用機制

周堤俠，呂海棟，金秉巾，劉國慶

全世界每年結直腸癌(colorectal cancer，CRC)發病例數達110萬，死亡患者例數達88萬[1]。近年來我國CRC的發病率亦有逐漸升高的趨勢，每年新發病例數約38萬，死亡例數約20萬[2]。CRC早期表現不明顯，發現時多為中晚期，尋找新的CRC腫瘤標志物有較大的臨床意義。神經生長因子受體介導的黑色素瘤抗原編碼基因同源蛋白(neurotrophin receptor-interacting MAGE homolog，NRAGE)編碼基因位于16q23.1，屬于黑色素瘤抗原基因家族成員，參與p75神經營養蛋白受體介導神經細胞的程序性細胞死亡[3]。NRAGE在口腔鱗癌[4]、肝癌[5]等多種類型的惡性腫瘤中均存在異常表達，并通過促進腫瘤細胞的增殖及轉移，促進腫瘤的惡性進展，有望成為新的腫瘤診斷治療的分子標志物。而目前CRC中NRAGE的表達及作用機制報道較少。該研究探討NRAGE對CRC細胞增殖和侵襲能力的作用機制，為臨床診治提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 病例資料選取2018年7月—2019年12月青海省人民醫院診治的84例CRC患者的臨床病理材料。納入標準：① CRC的診斷經病理學檢查明確；② 首次診治；③ 患者及家屬知情同意。排除標準：① 合并炎癥性腸病等胃腸道疾病；② 合并其他惡性腫瘤；③ 無放化療等腫瘤治療史。男50例，女34例；年齡29～79(53.1±7.3)歲；直腸癌30例，結腸癌54例；合并淋巴結轉移者19例，未合并淋巴結轉移者65例；合并遠處轉移9例，未合并遠處轉移75例；腫瘤直徑：≤3 cm 59例，>3 cm 25例；腫瘤分期：Ⅰ-Ⅱ期55例，Ⅲ-Ⅳ期29例；腫瘤分化程度：高中分化53例，低分化31例。

1.2 主要實驗材料NRAGE、Cyclin D1及N-cadherin單克隆抗體(ab104627、ab134175、ab18203, 美國Abcam公司)；Vimentin、E-cadherin單克隆抗體(sc-6260、sc-8426，美國Santa Cruz公司)。慢病毒過表達(pCDH-GFP-NARGE)及敲除NARGE基因的SW480細胞(Plko.1-puro-shNARGE)及對照空載SW480細胞(上海吉凱生物科技公司)；MTT細胞增殖檢測試劑盒(貨號：TB112, 美國Promega公司)；Transwell細胞培養板(貨號：3822，美國康寧公司)；Matrigel基質膠(貨號：356234，美國BD公司)；293T細胞、正常CRC細胞系FHC及腫瘤細胞系HT29、SW480、SW620、LOVO(美國ATCC公司，細胞培養條件：10%胎牛血清RPMI 1640培養基，37 ℃、5% CO2細胞培養箱)；SYBR Green PCR Mix(4312704，美國ABI公司)。

1.3 病毒包裝及SW480細胞感染將293T細胞接種于 10 cm 細胞培養皿，利用增強型磷酸鈣轉染試劑盒(MaxiCap, 北京邁晨科技公司)進行病毒包裝。體系：目的質粒6 μg，VSVG 1.5 μg，PAX 24.5 μg，HBS 1 ml，配好體系后, 加入CaCl267 μl充分混勻，靜置15 min后加入到培養皿中。6 h后換液。48 h后收集病毒上清液。4 ℃、1 500 r/min 離心15 min，上清液用 0.45 μm 濾器過濾。按照病毒液 ∶濃縮液=4 ∶1的比例加入病毒濃縮液，4 ℃過夜，取出離心管，4 ℃、7 000 r/min 離心10 min，棄上清液，加PBS重懸后分裝，-80 ℃保存。SW480細胞接種于6孔板，加polybrene(1 ∶1 000)和對應的病毒上清液，培養基2 ml，24 h后換液，加嘌呤霉素篩選SW480細胞(1 ∶2 000)3 d，用于下一步實驗。

1.4 RT-PCR檢測TRIzol法提取細胞中總RNA，以總RNA為模板，逆轉錄合成cDNA。以cDNA為模板進行RT-PCR檢測。引物序列見表1。反應體系20 μl，包括SYBR premix 10 μl、上游引物1 μl、下游引物1 μl、cDNA模板2 μl、無核糖核酸酶水6 μl。反應條件：95 ℃ 10 s，95 ℃ 40 s，65 ℃ 60 s，70 ℃ 10 s，共40個循環。目的基因的相對表達水平采用2-ΔΔCt法表示。

表1 引物序列

1.5 MTT增殖實驗將NC組、NRAGE過表達組、NRAGE敲低組細胞以每孔1×104個細胞的量接種至96孔板，每孔補培養基200 μl，每組3個復孔。待細胞貼壁后，培養0、24、48、72 h換液，加入20 μl MTT試劑，3 h后棄上清液，加入200 μl的DMSO溶解紫色的結晶物，然后酶標儀上450 nm波長處檢測各孔的吸光度值，結果取各濃度復孔的平均值。

1.6 Transwell實驗將Matrigel 基質膠與培養基以1 ∶8的比例稀釋制備工作濃度的基質膠，將工作濃度的基質膠包被24孔板的Transwell小室的上室面于37 ℃ 靜置30 min，基底膜用無血清培養基水化30 min。調整NC組、NRAGE過表達組、NRAGE敲低組細胞密度至50×104/ml。取200 μl加入上室，下室加入500 μl含20%胎牛血清的培養基。24 h后取出Transwell小室，用PBS洗2次，10%多聚甲醛固定40 min，0.5%結晶紫染色15 min，棉簽輕輕擦掉膜上層的細胞，PBS洗2次。鏡下(×400)隨機選取5個視野，數下室側貼壁細胞數目，結果取平均值。

1.7 免疫印跡實驗將NC組、NRAGE過表達組、NRAGE敲低組細胞以每孔3×105個接種至6孔板，待細胞貼壁長滿后，棄培養基，冷PBS洗2次，加RIPA細胞裂解液300 μl，冰上裂解10 min，將細胞刮下提取細胞蛋白。BCA法蛋白定量后，加5×SDS-上樣緩沖液，99 ℃金屬浴15 min。SDS-PAGE 膠電泳：濃縮膠恒壓80 V，分離膠恒壓120 V，濕轉法轉膜90 min恒流300 mA。將PVDF 膜放入5%脫脂奶粉中封閉2 h；TBST洗3次，每次10 min，一抗4 ℃孵育過夜，二抗室溫1 h。電化學發光法(ECL)暗室顯影照相。

2 結果

2.1 NRAGE在CRC癌組織中的表達與癌旁組織相比，癌組織中NRAGE mRNA的相對表達量為(2.631±0.303)、(1.054±0.212)。癌組織中NRAGE mRNA相對表達量明顯高于癌旁組織(t=40.475，P<0.001)；與癌旁組織相比，癌組織中NRAGE蛋白表達明顯較高，見圖1。

圖1 免疫印跡檢測癌組織與癌旁組織中NRAGE的蛋白表達T:癌組織；N:相應的癌旁組織；1～4:4組癌與癌旁組織

2.2 CRC癌組織中NRAGE的表達與臨床病理參數的關系CRC癌組織中NRAGE的表達與腫瘤分期、遠處轉移及淋巴結轉移有關(P<0.05)，而與性別、年齡、腫瘤大小、腫瘤位置、腫瘤分化程度無關。見表2。

表2 癌組織中NRAGE表達與臨床病理特征關系

2.3 CRC腫瘤細胞系及正常細胞系中NRAGE的表達CRC腫瘤細胞系HT29、SW480、SW620、LOVO NRAGE mRNA及蛋白明顯高于正常細胞系FHC(t=7.325、9.124、18.644、19.012，P<0.001)，高轉移性細胞系SW620、LOVO NRAGE mRNA及蛋白的表達明顯高于低轉移性CRC腫瘤細胞系HT29、SW480(t=5.378、5.105、7.709、7.913，P<0.001)。見圖2。

圖2 CRC腫瘤細胞系及正常細胞系中NRAGE的表達A：各細胞系NRAGE mRNA表達；B：各細胞系NRAGE 蛋白表達;與FHC比較：*P<0.05；

2.4 過表達或敲低NRAGE對SW480細胞增殖及遷移能力的影響免疫印跡實驗驗證NRAGE的過表達或敲低的效率良好，見圖3A。與NC組相比，NRAGE過表達組細胞活力較高(t=9.524，P<0.001)、侵襲細胞數增多(t=6.324，P<0.001)，而NRAGE敲低組細胞活力較低(t=11.132，P<0.001)、侵襲細胞數減少(t=8.748，P<0.001)，見圖3B、C。

圖3 NRAGE對SW480細胞增殖及遷移能力的影響A：SW480細胞NRAGE蛋白過表達及敲低效果驗證；B：各組細胞增殖能力比較；C:各組細胞侵襲能力比較 ×20；與NC組比較：*P<0.05

2.5 過表達或敲低NRAGE對SW480細胞增殖及上皮間質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)相關指標的影響與NC組相比，過表達NRAGE組SW480細胞CyclinD1、N-cadherin及Vimentin的mRNA及蛋白表達升高，E-cadherin的mRNA及蛋白表達降低，NRAGE敲低組SW480細胞CyclinD1、N-cadherin及Vimentin的mRNA及蛋白表達降低，E-cadherin的mRNA及蛋白表達升高(P<0.05)。見圖4A、B。

圖4 過表達或敲低NRAGE對SW480細胞增殖及EMT相關指標的影響A：各組增殖及EMT相關指標mRNA表達比較；B：各組增殖及EMT相關指標蛋白表達比較；與NC組比較：*P<0.05

2.6 NRAGE通過ERK信號通路調節SW480細胞增殖及遷移能力與NC組相比，過表達NRAGE組SW480細胞p-ERK1/2蛋白表達較高，而ERK1/2、AKT及p-AKT表達無明顯差異，見圖5A。予過表達NRAGE組SW480細胞應用ERK抑制劑U0126(20 μmol/L)24 h后，NRAGE組+U0126組細胞的增殖及遷移能力明顯降低。見圖5B、C。

圖5 NRAGE通過ERK信號通路調節SW480細胞增殖及遷移能力A：各組ERK信號通路蛋白表達；B：各組細胞增殖能力比較；C：各組細胞侵襲能力比較 結晶紫染色×20；與NRAGE過表達組比較：*P<0.05

3 討論

CRC的病因包括遺傳因素、飲食及慢性炎癥刺激等，多種因素共同作用導致基因或染色質結構的不穩定，引起多種癌基因的過度激活或(和)抑癌基因的失活，表現為無限增殖、凋亡抑制、免疫抑制、代謝改變及獲得浸潤轉移等惡性生物學潛能。深入研究CRC的病因及發病機制，尋找新的CRC腫瘤標志物對于臨床上CRC的早期診斷、治療藥物的研發及治療效果評估具有重要臨床價值。

黑色素瘤相關抗原(MAGE)基因家族成員包括Ⅰ型和Ⅱ型[6]。具有高度保守特征的Ⅱ型MAGE基因在人類、小鼠和斑馬魚中廣泛表達，在生命個體的分化發育中起著至關重要的作用。NRAGE基因屬于Ⅱ型MAGE亞家族，具有多種功能，包括調節細胞凋亡、細胞分化、生物鐘、情緒調節等[7]。研究[8-9]表明，NRAGE在肝癌、乳腺癌等腫瘤中表達下調，而在食管癌、胃癌等消化道腫瘤中表達上調，參與影響惡性腫瘤的進展、轉移和侵襲等生物學行為。該研究顯示，CRC癌組織中NRAGE mRNA及蛋白表達明顯上調，并與正常結直腸黏膜FHC細胞相比，CRC腫瘤細胞中NRAGE mRNA及蛋白表達均較高，目前CRC中NRAGE表達上調的機制尚不清楚，可能與ERK信號通路的過度激活有關。Jiang et al[10]在胃癌的研究中發現，ERK及ZO-1的磷酸化水平升高能促進NRAGE的表達，進而促進胃癌腫瘤細胞的浸潤及轉移。該研究結果顯示，NRAGE的表達與腫瘤分期、淋巴結轉移及遠處轉移有關，表明NRAGE的高表達參與促進CRC的腫瘤進展及轉移。Sun et al[11]研究報道，腫瘤中NRAGE的高表達能夠通過抑制細胞周期抑制因子P27的表達，促進腫瘤細胞G1/S周期的轉換，促進腫瘤細胞的增殖，導致腫瘤分期升高。本研究顯示，在SW480細胞中過表達NRAGE后，CyclinD1表達上調，因而NRAGE可能通過促進CyclinD1的表達，促進細胞周期的進行，導致腫瘤分期增高。為進一步研究NRAGE對CRC腫瘤細胞生物學行為的影響，通過MTT增殖實驗及Transwell遷移實驗對過表達或敲除NRAGE的SW480細胞進行功能驗證，結果NRAGE過表達的SW480細胞增殖及遷移能力較NC組明顯增強，而敲除NRAGE的SW480細胞增殖及遷移能力減弱。表明CRC中NRAGE的表達增加促進腫瘤細胞增殖及遷移。以往亦有研究[12]證實，NRAGE的表達水平升高能夠激活下游癌基因如Ror2、Src等的表達，進而促進基質金屬蛋白酶(MMP)1、MMP9的表達，導致細胞之間黏附能力減弱，促進腫瘤細胞的局部浸潤和轉移。EMT可促進腫瘤細胞的浸潤轉移能力，而EMT的調控是一個復雜的網絡，涉及 TGFβ家族，Wnts、Notch和HIF等多個信號通路的異常改變，表現為細胞上皮-基底極性的喪失，上皮性標志E-cadherin表達的下調及間質性標志N-cadherin表達的上調[13]。因此，可假設NRAGE可能通過促進CRC細胞發生EMT，獲得局部浸潤及遠處轉移的能力。為驗證該假設，本實驗檢測過表達或敲低NRAGE后，SW480細胞中EMT相關指標如E-cadherin、N-cadherin及Vimentin的表達，結果顯示，與NC組相比，過表達NRAGE組的細胞N-cadherin及Vimentin表達較高，而E-cadherin表達較低，表明NRAGE的表達能夠促進CRC細胞發生EMT，增強腫瘤細胞的浸潤及遷移能力。馮振華[14]的研究提示，NRAGE的表達受到MAPK/ERK和AKT/PKB通路的表達調控，干擾NRAGE基因的表達可以抑制AKT激酶及ERK活性,也降低AKT及ERK的磷酸化水平，誘導腫瘤細胞的分化[15]。為分析SW480細胞中NRAGE促進腫瘤細胞的增殖及遷移的機制，該研究初步探索過表達NRAGE后ERK1/2、p-ERK1/2、AKT及p-AKT的表達情況，顯示過表達NARGE后p-ERK1/2表達顯著上調，并且加入ERK1/2抑制劑U0126后，NRAGE促進SW480細胞增殖及遷移的能力受到顯著抑制，提示NRAGE可能通過促進ERK1/2的磷酸化，促進腫瘤細胞的增殖和遷移。