單肺通氣誘發兔肺損傷時花生四烯酸代謝通路變化及丹參多酚酸鹽的干預研究

陳 華，張柏盛，龍小平

胸外科手術(如食管癌根治術、肺葉切除術等)的通氣方式通常首選單肺通氣(one lung ventilation,OLV)技術，通過隔離患側肺，從而使氣道通暢，避免發生交叉感染，同時為手術治療建立良好的操作環境[1-2]。但是此技術會增加肺內分流與氣道阻力，危及肺泡氧合機能與肺組織順應性，造成急性肺損傷，對患者生命與術后恢復產生極大危害[3-4]。

丹參多酚酸鹽是從丹參中提取的一種水溶性有效成分，與傳統丹參注射液相比，具有療效穩定、毒副反應小、質量容易監控等優點，臨床上主要用于冠心病的治療[5-6]。丹參多酚酸鹽對急性肺損傷有保護作用，但對OLV誘發肺損傷的保護機制尚不清楚。該研究通過建立兔OLV模型，探討丹參多酚酸鹽對其所產生的效用以及可能機制，為后續研究提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 動物與分組24只健康雌、雄性6月齡日本白兔，體質量2.2～2.5 kg，購自廣東省醫學科學院醫學研究中心，許可證號：SCXK(粵)2015-0022。使用許可證號SYXK(湘)2017-0015。實驗動物隨機分為對照組、模型組、治療組，每組8只；對照組：行假手術，暴露氣管、左頸總動脈和右頸外靜脈，經2～3個氣管環行氣管切開，置入氣管(內徑2.0 mm)，雙肺通氣3 h；模型組：調整氣管導管至右主支氣管，行機械通氣2 h，OLV 3 h；治療組在OLV前給予丹參多酚酸鹽30 mg/kg靜脈滴注，其余與模型組相同。3組均采用容量通氣模式，通氣頻率40次/min，OLVVT為12 ml，FiO2100%。試驗結束后2 h開胸取肺組織，部分于4%多聚甲醛中固定，剩余肺組織于液氮中保存。實驗過程符合動物3R原則。

1.2 儀器與試劑丹參多酚酸鹽(上海綠谷藥業)；花生四烯酸(arachidonic acid, AA)、白三烯B4(leukotriene B4, LTB4)、血栓素B2(thromboxane B2,TXB2)和6-keto-PGF1α檢測ELISA試劑盒(上海樊克生物科技有限公司)；環氧化酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)、5-脂氧化酶(5-lipoxygenase, 5-LOX)、Clara細胞分泌蛋白(clara cell secretory protein, CCSP)和胞質型磷脂酶A2(cytoplasmic phospholipase A2,C-PLA2)抗體(美國Sigma公司);逆轉錄和 PCR 反應試劑(日本Invitrogen公司)；TRIzol 試劑盒(美國TaKaRa公司)；多功能麻醉機(美國Datex Ohmeda公司)；H500型透射電子顯微鏡(日本Hitachi公司)；9600PCR 擴增儀(美國PE公司)。

1.3 肺濕/干重值(wet / dry weight, W/D值)取兔右肺下葉組織稱濕重，然后置于恒溫烤箱中(80 ℃、72 h)烘烤，至恒重后稱干重，計算肺濕/干重之比(W/D值)。

1.4 肺組織學評分取右肺組織，浸泡于4%多聚甲醛中固定24 h，常規脫水、石蠟包埋、二甲苯脫蠟、經各級乙醇溶液至水洗，然后HE染色，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。

1.5 透射電子顯微鏡肺組織標本用2.5%戊二醛固定，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗，再1%四氧化鋨固定2 h，樣品在室溫下通過丙酮脫水，環氧樹脂Epon812包埋，切片，用透射電鏡檢查。

1.6 ELISA法檢測肺組織中AA、LTB4、6-keto-PGF1α和TXB2含量由于血栓素A2(thromboxane A2, TXA2)和前列環素(prostacyclin 2, PGI2)組織半衰期分別為30 s、3 min，因此判斷濃度采用其穩定代謝產物TXB2和6-酮-前列環素F1α(6-keto-PGF1α)值作為指標。按照ELISA試劑盒說明書操作，檢測兔肺中AA、6-keto-PGF1和TXB2的含量。

1.7 RT-qPCR檢測兔肺組織COX-2、5-LOX mRNA表達水平取重約50 mg肺組織，置于TRIzol中提取總RNA，并測定總RNA濃度。按逆轉錄試劑盒說明書合成cDNA，采用SYBR Green MasterMix試劑盒(美國Kapa公司)進行實時定量PCR實驗。β-actin作為內參，上游引物：5′-AGAGAACACCCAA GCCACT-3′；下游引物：5′-GGCATCGGAAAGGCACA AACG-3′。5-LOX上游引物：5′-GCCGTCTATGAACA CGCGTGT-3′；下游引物：5′-GTCTCTAGATGAAGTTG G-3′。COX-2上游引物：5′-TCAGTCGATCACGAGTGA-3′；下游引物：5′-CTAATGACAAGCCAGGGA-3′。以2-ΔΔCt計算各樣品表達量的相對值，對照組相對值均設為1。

1.8 Western blot法檢測AA代謝途徑相關蛋白表達取肺組織100 mg，加1 ml組織裂解液，勻漿后經BCA法測定蛋白濃度。采用SDS-PAGE 凝膠電泳、轉膜、封閉后，加一抗、二抗孵育，用TBST漂洗10 min×3次，室溫下反應1 h，采用ECL顯影。

2 結果

2.1 肺W/D值與對照組相比，模型組肺W/D值升高(P<0.05)，而治療組肺W/D值低于模型組(P<0.05)，見圖1。

圖1 兔肺W/D值與對照組比較：*P<0.05；與模型組比較：#P<0.05

2.2 肺組織HE染色及評分對照組肺組織無明顯病理改變；模型組毛細血管擴張充血，肺泡腔內有紅色滲出物，肺泡壁增厚，炎性細胞浸潤；治療組部分肺泡破壞融合，肺間質有少量紅細胞以及炎性細胞浸潤，與模型組比較有所減輕，見圖2。

圖2 3組肺組織HE染色 ×100A：對照組；B：模型組；C：治療組

2.3 透射電鏡觀察肺組織病理學改變對照組顯示肺泡Ⅰ型上皮細胞(alveolar epithelial cell I,AT-Ⅰ)損傷較輕。而模型組線粒體腫脹，多數線粒體嵴斷裂甚至消失空泡變性，內質網顯著擴張，形成不同大小的液泡變性。治療組AT-Ⅰ超微結構損傷較模型組明顯改善，見圖3。

圖3 各組肺組織超微結構的變化 ×50 000A：對照組；B：模型組；C：治療組；黑色箭頭：線粒體；紅色箭頭：內質網

2.4 各組肺組織中AA、LTB4、TXA2、PGI2含量比較與對照組相比，模型組或治療組肺組織中AA、LTB4、TXA2和PGI2含量上升(t=6.39、9.31、5.98、7.05，P<0.05;t=2.17、9.01、1.79、6.33，P<0.05)；與模型組相比，治療組肺組織中AA、LTB4、TXA2和PGI2含量下降(t=3.87、2.76、1.43、2.22，P<0.05)，見圖4。

圖4 各組肺組織中LTB4、TXA2、PGI2、AA含量A: LTB4含量；B: PGI2(6-k-PGF1α)含量；C: TXA2(TXB2)含量；D: AA含量；與對照組比較：*P<0.05；與模型組比較：#P<0.05

2.5 各組肺組織中COX-2、5-LOX mRNA表達水平與對照組相比，模型組或治療組兔肺組織中5-LOX、COX-2 mRNA表達水平上升(t=30.55、27.89，P<0.01；t=77.31、12.30，P<0.01)，而與模型組相比，治療組兔肺組織中COX-2、5-LOX mRNA表達水平下降(t=18.16、18.55，P<0.01)，見圖5。

圖5 肺組織中COX-2、5-LOX 表達A: 5-LOX mRNA相對表達；B: COX-2 mRNA相對表達；與對照組比較：**P<0.01；與模型組比較：##P<0.01

2.6 各組肺組織COX-2、5-LOX、CCSP和C-PLA2蛋白表達與對照組相比，模型組兔肺組織中COX-2、5-LOX 和C-PLA2蛋白表達上升，而CCSP蛋白表達下降；與模型組相比，治療組兔肺組織中COX-2、5-LOX 和C-PLA2蛋白表達下降，而CCSP蛋白表達上升，見圖6。

圖6 各組肺組織中COX-2、5-LOX、CCSP和C-PLA2蛋白表達

3 討論

OLV拓展了胸科手術適應證，改善了手術條件，近年隨著胸腔鏡技術的成熟，其應用更加廣泛。但這種通氣方式屬于非生理性通氣，會提高氣道阻力、減弱肺順應性及肺泡局部通氣機能，術中易發生低氧血癥，使肺部缺血癥狀加劇，導致肺損傷更為嚴重[7]。

經大量研究[5]證實，丹參多酚酸鹽具有多環節、多靶點的藥理作用特點，不僅有抗心肌缺血、保護缺血-再灌注損傷、保護心肌等作用，還有保護肝膽、改善腎功能等作用。本研究擬評價經丹參多酚酸鹽治療后對OLV誘發肺損傷的效用及對AA代謝途徑的影響，以期為明確可能作用機制提供參考。

W/D值結果顯示：模型組W/D值高于對照組，而經丹參多酚酸鹽治療后W/D值下降。這說明OLV會誘發肺損傷，致使W/D值上升；透射電鏡觀察顯示：對照組顯示AT-Ⅰ損傷較輕，而模型組線粒體腫脹，內質網顯著擴張。治療組AT-Ⅰ超微結構損傷較模型組明顯改善。這也證實OLV對肺組織產生損傷作用，而經丹參多酚酸鹽治療后能明顯改善狀況，具有保護作用。

AA及其代謝物質如白三烯類(LTs)、TXA2、前列腺素類等是具有廣泛生物學活性的重要炎性介質，在許多疾病的發生發展中起著重要作用[8-10]。對于哺乳動物而言，AA代謝途徑主要有2類[11-12]：① 脂氧化酶(LOX)途徑，大多源自5-LOX發揮致炎效能；② 環氧化酶(COX)途徑。此途徑可分泌PGE2、TXA2、PGF2與PGI2等生物活性物質。文獻[13]報道，眾多的AA代謝產物中，對炎癥反應影響最大的是PGI2，其抑制血小板聚集、舒張血管方面表現出強大作用；TXA2具有很強的收縮血管作用，可誘發血栓及加速血小板聚集。在LOX途徑中，5-LOX是催化AA生成LTs物質的為主要途徑[14]。其中代謝產物LTB4對炎癥反應影響較大，與多種疾病的炎癥反應密切相關。ELISA檢測結果顯示模型組肺組織中AA、LTB4、PGI2、TXA2含量均高于對照組，而丹參多酚酸鹽治療后上述含量較模型組均下降。這說明OLV誘發的肺損傷會引起AA代謝途徑炎性物質的大量生成，而丹參多酚酸鹽能起到抑制AA代謝途徑的作用。

Western blot和RT-qPCR結果顯示，模型組肺組織中5-LOX、COX-2蛋白和mRNA表達水平上升，出現急性肺損傷，而經丹參多酚酸鹽治療后5-LOX、COX-2蛋白和mRNA表達下降。這提示OLV能使5-LOX 與COX-2這兩條代謝途徑活化，導致經其產生的AA代謝產物增加，出現肺損傷，而丹參多酚酸鹽對5-LOX 與COX-2這兩條代謝途徑均有抑制作用，因此能夠起到減輕急性肺損傷作用；C-PLA2廣泛參與人體炎癥反應，通過催化細胞內膜磷脂水解，產生以AA為主的游離脂肪酸和溶血磷脂，因此被認作是AA類產物生成及其所致后續炎癥反應中最為重要的酶。而Clara細胞分泌蛋白是Clara細胞的主要分泌產物，被認為是PLA2強烈的內源性抑制劑，具有較強的抗炎作用。Western blot結果還顯示，與模型組相比，治療組肺組織C-PLA2表達下降，而CCSP表達上升。這說明丹參多酚酸鹽能夠下調C-PLA2表達，上調CCSP表達，抑制AA等炎性產物生成，繼而對OLV誘發的肺損傷起到保護功效。由上述結果推測，丹參多酚酸鹽可能通過抑制5-LOX，下調該途徑主要產物LTB4表達，從而減少TXA2生成，起到炎癥抑制作用。同時，丹參多酚酸鹽還能通過抑制COX-2表達，從而減少代謝產物PGI2產生，進而下調TXA2生成。

綜上，本研究證實OLV可激活COX和5-LOX途徑導致AA代謝增加，而丹參多酚酸鹽可能通過下調5-LOX、COX-2、C-PLA2表達，上調CCSP表達從而抑制AA代謝途徑，對OLV誘發的肺損傷產生保護作用。