轉谷氨酰胺酶2基因敲低對肺癌細胞增殖和侵襲的抑制作用

張建新, 劉雨露, 朱子貴, 趙 紅, 姚平波

肺癌是一種與吸煙、輻射、遺傳、環境等因素有關的呼吸道惡性腫瘤，早期通常不表現明顯癥狀，隨病情發展可出現咳嗽、咯血、胸痛、消瘦等[1]。肺癌惡性程度較高，可以直接擴散或者經血、淋巴道轉移至周圍的組織，預后較差[2]。轉谷氨酰胺酶2(transglutaminase 2，TGM2)屬于轉谷氨酰胺家族，可以催化蛋白質多肽內部的結構變化，調控蛋白分子間的相互作用，調控多種腫瘤細胞的生長和轉移[3-4]。近年來研究[5]顯示，TGM2高表達可以促進肺癌細胞的侵襲，在肺癌的惡性進展中發揮重要作用。但目前國內關于TGM2在肺癌中研究報道較少，且其作用于肺癌的機制尚不明確。該研究探討了TGM2基因干擾對肺癌細胞的作用及可能機制，旨在為肺癌新靶向藥物的研發提供一定的理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器3111型CO2培養箱購自美國Thermo Scientific公司；多功能酶標檢測儀(iMark 680)購自美國Bio-Rad公司；光學顯微鏡(BX60型)購自日本Olympus公司；IQTM5型熒光定量PCR儀購自美國Bio-Rad公司；FACScan流式細胞儀購自美國FranklinLakes；A549細胞購自中科院上海生命科學研究院；TGM2-shRNA質粒(TGM2-shRNA1：5′-CCGGTGAGAAATACCGTGACTGCCTCTCGAGAGGC AGTCACGGTATTTCTCATTTTT-3′，作用位點為NM_004613.x-1779s1c1；TGM2-shRNA2：5′-CCGGCCACCCACCATATTGTTTGATCTCGAGATCAAACAATATG GTGGGTGGTTTTT-3′，作用位點為NM_004613.x-2519s1c1；TGM2-shRNA3：5′-CCGGAGAAATACCGTGACTGCCTTACTCGAGTAAGGCAGTCACGGTATTTC TTTTTT-3′，作用位點為NM_004613.x-1781s1c1；shRNA NC：5′-CCGGTTCTCCGAACGTGTCACGTTT CAAGAGAACGTGACACGTTCGGAGAATTTTT-3′)、TGM2 mRNA的RT-PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成；RT-PCR反應相關試劑盒、lipofectamineTM2000試劑盒、Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒購自上海源葉生物科技有限公司；兔抗人E鈣黏蛋白(E-cadherin，E-cad)、N鈣黏蛋白(N-cadherin，N-cad)、纖連蛋白(fibronectin，FN)和血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、β-actin、辣根過氧化酶(horseradish peroxidase，HRP)標記羊抗兔二抗購自美國CST中國公司。

1.2 A549細胞培養及轉染將A549細胞接種于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養液，37 ℃、5% CO2培養箱中培養至80%融合時，開始進行傳代培養。取對數期細胞進行脂質體轉染，按照操作說明將lipofectamineTM2000分別與shRNA-NC、TGM2-shRNA1、TGM2-shRNA2和TGM2-shRNA3進行稀釋混合，瞬時轉染6 h后，更換為完全培養基繼續培養24 h后，收取細胞。采用RT-PCR檢測轉染各組A549細胞中TGM2 mRNA水平，PCR上游引物：5′-CCCAGCAGGGCTTTATCTACCA-3′，下游引物：5′-GCAGATGTCTAGGATCCCATCTTCA-3′，以GAPDH為內參，采用2-ΔΔCt法分析TGM2 mRNA的相對表達量。Western blot檢測轉染各組A549細胞中TGM2蛋白表達水平。選擇干擾后相對表達量最低的shRNA1進行后續的細胞實驗。

1.3 細胞分組取對數生長期A549細胞，調整細胞濃度為1×105個/ml，將其分為對照組(Control)、shRNA-NC組(shRNA-NC)、TGM2-shRNA1組(TGM2- shRNA1)。對照組只加入lipofectamineTM2000，shRNA-NC組轉染shRNA-NC，TGM2-shRNA1組轉染TGM2-shRNA1。

1.4 A549細胞的克隆形成率測定取各組轉染后對數生長期A549細胞，調整為單細胞懸液(1×105個/ml)，以2×104個/孔接種于37 ℃、5%CO2培養箱中繼續培養12～14 d，待孔中大多數克隆中的細胞數量大于50個，PBS輕輕洗滌2次，每孔加入4%多聚甲醛室溫固定10 min后，每孔加入1%結晶紫染色5 min，觀察每孔內A549細胞的克隆形成情況。

1.5 CCK-8法檢測A549細胞的增殖取各組轉染后對數生長期A549細胞，調整為單細胞懸液(1×105個/ml)，以2×104個/孔接種于96孔板中培養，每組設置3個復孔，繼續培養，分別于培養1、2、3、4 d進行CCK-8檢測，嚴格按照試劑盒的說明書進行操作，采用酶標儀檢測波長為450 nm時，各個孔的吸光度值。

1.6 流式細胞儀檢測A549細胞凋亡取各組轉染后對數生長期A549細胞，調整為單細胞懸液(1×105個/ml)，PBS洗滌2次后，采用Annexin V-FITC/PI雙染法進行染色，上流式細胞儀檢測細胞凋亡率，嚴格按照凋亡試劑盒的說明書進行實驗操作。

1.7 Transwell檢測A549細胞的侵襲力取各組轉染后對數生長期A549細胞，調整為單細胞懸液(1×105個/ml)，向Transwell上室(自帶Matrigel膠)加入100 μl稀釋好的細胞懸液，然后加入200 μl的無血清培養基，下室為常規的含質量分數10%胎牛血清的RPMI 1640培養液，培養48 h后，取出Transwell小室，除去上腔底部剩余的細胞，采用Diff-Quik Fix固定2 min，diff-quick染色液進行染色，清水洗3次以上，顯微鏡下觀察觀察下室侵襲的細胞數。

1.8 小管形成實驗檢測A549細胞小管形成數目取各組轉染后對數生長期A549細胞，調整為單細胞懸液(1×105個/ml)，以2×104個/孔接種于鋪Matrigel基質膠(冰上預冷，避免氣泡出現)的24孔板，進行常規培養，每間隔4 h，密切監測細胞小管結構變化，在顯微鏡下觀察A549細胞的小管結構，繼續培養16 h后，計數細胞小管形成數目。

1.9 Western blot檢測E-cad、N-cad、FN和VEGF蛋白表達水平取各組轉染后對數生長期A549細胞，采用細胞裂解液提取A549細胞的總蛋白，并進行蛋白定量，經聚丙烯酰胺凝膠電泳后，轉膜至PVDF，加入5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，加入一抗(分別為E-cad、N-cad、FN和VEGF，β-actin為內參，稀釋比例均為1 ∶1 000)，4 ℃孵育過夜，洗膜緩沖液洗膜后加入二抗(稀釋比例為1 ∶5 000)，室溫孵育2 h，化學發光顯影，采用凝膠圖像分析系統對比條帶強弱。

2 結果

2.1 TGM2基因干擾后肺癌細胞中TGM2表達RT-PCR和Western blot檢測結果顯示，TGM2-shRNA組細胞TGM2 mRNA水平和蛋白表達低于shRNA-NC組(F=277.416、348.639，P<0.05)，其中轉染TGM2-shRNA1后TGM2 mRNA水平和蛋白表達最低。見圖1。

圖1 TGM2基因干擾后肺癌細胞中TGM2表達A：RT-PCR檢測A549細胞mRNA水平；B：Western blot檢測A549細胞TGM2蛋白表達；1：對照組；2：shRNA-NC組；3：TGM2-shRNA1組；4：TGM2-shRNA2組；5：TGM2-shRNA3組；與shRNA-NC組比較：#P<0.05

2.2 TGM2基因干擾對肺癌細胞克隆形成率的影響克隆形成實驗結果顯示，對照組與shRNA-NC組A549細胞的克隆形成率差異無統計學意義；與shRNA-NC組比，TGM2-shRNA1組A549細胞的克隆形成率降低(F=62.534，P<0.05)。見圖2。

圖2 TGM2基因干擾對肺癌細胞克隆形成率的影響 結晶紫染色×100A：克隆形成實驗檢測A549細胞克隆形成情況；B：A549細胞克隆形成率；1：對照組；2：shRNA-NC組；3：TGM2-shRNA1組；與shRNA-NC組比較：#P<0.05

2.3 TGM2基因干擾對肺癌細胞增殖活性的影響CCK-8檢測結果顯示，對照組與shRNA-NC組A549細胞的增殖活性差異無統計學意義；與shRNA-NC組比，TGM2-shRNA1組A549細胞的增殖活性降低(F=47.339，P<0.05)。見圖3。

圖3 TGM2基因干擾對肺癌細胞的增殖活性的影響與shRNA-NC組比較：#P<0.05

2.4 TGM2基因干擾對肺癌細胞凋亡率的影響流式細胞儀檢測結果顯示，與shRNA-NC組相比，對照組A549細胞的凋亡率差異無統計學意義； TGM2-shRNA1組A549細胞的凋亡率升高，差異有統計學意義(F=75.827，P<0.05)。見圖4。

圖4 TGM2基因干擾對肺癌細胞凋亡率的影響A：流式細胞儀檢測A549細胞凋亡；B：A549細胞凋亡率；1：對照組；2：shRNA-NC組；3：TGM2-shRNA1組；與shRNA-NC組比較：#P<0.05

2.5 TGM2基因干擾對肺癌細胞侵襲能力的影響Transwell檢測結果顯示，與shRNA-NC組相比，對照組侵襲A549細胞數差異無統計學意義；TGM2-shRNA1組侵襲A549細胞數下降，差異有統計學意義(F=52.930，P<0.05)。見圖5。

圖5 TGM2基因干擾對肺癌細胞侵襲能力的影響 Diff-Quik×400A：Transwell檢測A549細胞侵襲；B：侵襲A549細胞數；1：對照組；2：shRNA-NC組；3：TGM2-shRNA1組；與shRNA-NC組比較：#P<0.05

2.6 TGM2基因干擾對肺癌細胞侵襲相關蛋白的影響Western blot檢測結果顯示，與shRNA-NC組相比，對照組A549細胞E-cad、N-cad和FN蛋白表達差異無統計學意義；TGM2-shRNA1組A549細胞E-cad蛋白表達升高，N-cad和FN蛋白表達下降，差異有統計學意義(F=76.315、143.342、102.716，P<0.05)。見圖6。

圖6 TGM2基因干擾對肺癌細胞侵襲相關蛋白的影響A：Western blot檢測A549細胞蛋白表達圖譜；B：A549細胞E-cad、N-cad和FN蛋白相對表達量；與shRNA-NC組比較：#P<0.05

2.7 TGM2基因干擾對肺癌細胞小管形成數及VEGF蛋白表達的影響小管形成實驗結果顯示，對照組與shRNA-NC組A549細胞小管形成數差異無統計學意義；與shRNA-NC組比，TGM2-shRNA1組A549細胞小管形成數減少(F=53.373，P<0.05)。Western blot檢測結果顯示，與shRNA-NC組相比，對照組A549細胞VEGF蛋白表達差異無統計學意義；TGM2-shRNA1組A549細胞VEGF蛋白表達下降，差異有統計學意義(F=162.451，P<0.05)。見圖7。

圖7 TGM2基因干擾對肺癌細胞小管形成數及VEGF蛋白表達的影響A：小管形成實驗檢測A549細胞小管形成數，箭頭所指為小管 ×40；B：A549細胞小管形成數；C：Western blot檢測A549細胞蛋白表達；1：對照組；2：shRNA-NC組；3：TGM2-shRNA1組；與shRNA-NC組比較：#P<0.05

3 討論

肺癌是一種預后較差的呼吸道惡性腫瘤，近年來有研究基于肺癌的發病機制，研發了多種小分子靶向藥物，并將其應用于臨床，取得了較好的臨床療效，可以改善晚期肺癌患者的預后[6]。TGM2是近年來研究比較多的一種廣泛存在于人體的蛋白質酰基轉移酶，在胃癌、乳腺、肺癌等許多惡性腫瘤中均出現表達異常升高，且異常升高的TGM2可以調控腫瘤細胞的惡性進展。該研究中，相較于正常的A549細胞，TGM2基因沉默后，A549細胞的克隆形成率和增殖活性降低，細胞的凋亡率升高。研究結果表明，TGM2基因可以調控A549細胞惡性生物學行為，TGM2基因沉默可以抑制肺癌A549細胞的生長，誘導細胞凋亡。研究[7]顯示，TGM2高表達可以調節Wnt/β-catenin信號通路表達，促進結直腸癌細胞的血管生成，還可以激活NF-κB信號通路，改變腫瘤微環境，促進腫瘤細胞增殖，抑制細胞凋亡，提示TGM2基因可能通過調節相關蛋白的表達，調控肺癌的惡性進展，有望成為肺癌治療的新靶點，但其具體的調控機制有待于進一步研究。

該研究中，TGM2基因沉默后，A549細胞的侵襲細胞數降低。肺癌細胞的侵襲力是腫瘤細胞侵犯鄰近血管、組織的基礎，是影響患者肺癌預后的關鍵，提示TGM2基因沉默可以抑制肺癌的轉移，改善患者預后。該研究中，TGM2基因沉默可以促進A549細胞E-cad蛋白表達，抑制N-cad和FN蛋白表達水平。E-cad和N-cad蛋白均為機體重要的Ca2+依賴的跨膜蛋白，其中E-cad廣泛分布于多種正常上皮細胞，對于維持細胞形態和細胞間連接具有重要的作用，可以介導腫瘤細胞間的相互作用，其表達下調是細胞發生間質轉換的標志[8]。N-cad在正常上皮細胞表達水平較低，N-cad蛋白表達上調可以誘導細胞表型發生間質轉換，介導腫瘤細胞表面的黏附作用，增強肺癌細胞侵襲的能力[9]。FN是廣泛存在于細胞表面的蛋白，是細胞外基質的重要組成成分，也可以介導細胞間黏附作用，參與腫瘤細胞的遷移、黏附、侵襲等多種生物學過程[10]。Shan et al[11]研究表明，TGM2可以調節細胞外基質穩定性，誘導細胞內骨架重建，調節腫瘤細胞的間質轉化和侵襲，提示TGM2基因沉默可以影響細胞外基質的形成，抑制A549細胞的表型轉換，抑制腫瘤轉移。

該研究中，TGM2基因沉默后，A549細胞的小管形成數降低。小管形成實驗是臨床常用的一種評估血管生成的方法，可以反應腫瘤細胞的血管形成情況[12]。已有研究[13]顯示，血管形成數可以反映腫瘤細胞的增殖和侵襲能力，抑制腫瘤細胞的血管形成，可以抑制腫瘤的惡性進展，提示TGM2基因沉默后，A549細胞的血管形成減少，增殖活性和侵襲能力下降。該研究中，TGM2基因沉默后，A549細胞VEGF蛋白表達降低。VEGF是細胞內最重要的促血管生成因子，可以促進肺癌細胞血管的生成，為肺癌細胞惡性增殖提供營養，同時也為肺癌的侵襲和遷移提供途徑[14]。Lee et al[15]研究顯示，TGM2干擾可以抑制VEGF蛋白表達，抑制VEGF誘導的纖維化，促進血管內皮E-cad蛋白表達，提示TGM2基因沉默可能通過抑制A549細胞VEGF蛋白的表達，抑制肺癌細胞的惡性生物學行為。

綜上所述，TGM2基因沉默可以抑制A549細胞VEGF蛋白表達，抑制血管形成，抑制肺癌細胞的增殖和侵襲，誘導細胞凋亡。