SHP-2抑制劑PHPS1對動脈粥樣硬化斑塊作用及其機制的研究

張 雪，馬 倩，李新新，譚 鶴，朱學燦，帖彥清

易損動脈粥樣硬化(atherosclerotic， AS)斑塊是導致心肌梗死、卒中等致死、致殘性心腦血管疾病的主要病因，又被稱為“犯罪斑塊”，所以如何穩定易損斑塊是重要的研究方向，對減少疾病發生具有重要臨床意義。AS易損斑塊的主要病理學特征為大的壞死核心，其上覆蓋有薄的、并不連續的纖維帽，膠原成分及斑塊內平滑肌細胞(smooth muscle cells, SMCs)減少，巨噬細胞成分增加[1-2]。巨噬細胞是參與斑塊形成和炎癥因子分泌的主要細胞，其可通過分泌多種基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMPs)來降解膠原，促使斑塊不穩定性增加，極易破裂受損，其中研究較多，作用較清晰的為MMP-1、MMP-2、MMP-9等，所以抑制這些基質金屬蛋白酶的分泌可以加強斑塊的穩定性，使其不易破裂。巨噬細胞內部有許多信號通路，通過這些信號通路來調節體內各種反應，有些研究[2-4]中表明：巨噬細胞中的細胞外調節蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases, ERK)信號通路是調節基質金屬蛋白酶(MMP-9)表達的主要調控途徑，ERK通路的激活是決定斑塊破裂的重要原因之一。研究[5]表明蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-2(scr homology 2 domain-containing protein tyrosine phosphatase-2,SHP-2)主要通過調控ERK的活性來影響斑塊，該研究使用SHP-2特異性抑制劑PHPS1干預ApoE-/-小鼠來說明抑制SHP-2對AS穩定性的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、試劑及實驗儀器16只8周齡體質量(20±5)g SPF級ApoE-/-小鼠購自常州卡文斯實驗動物技術有限公司，飼養于河北省人民醫院臨研中心SPF級動物房，每籠4～6只，適應性飼養1周后開始實驗，本動物實驗經過了醫學倫理委員會的批準并按實驗動物使用的 3R 原則給予人道關懷；抗CD 68、抗MMP-9、抗ERK及p-ERK、山羊抗兔 IgG H&L (HRP)、山羊抗鼠IgG H&L(Alexa Fluor?488)預吸附二抗購自英國Abcam 公司；DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋公司；蛋白裂解液、PMSF、蛋白酶磷酸酶抑制劑、BCA蛋白試劑盒均購自北京索萊寶公司；PHPS1及天狼星紅染液均購自美國sigma aldrich公司；西方膳食飼料購自江蘇美迪森生物醫藥有限公司；正置顯微鏡(德國Carl zeiss公司)、石蠟切片機(德國Leica公司)。

1.2 動物分組及標本取材16只6～8周齡雄性ApoE-/-小鼠隨機分為2組，8只/組。PHPS1處理組給予腹腔注射3 mg/(kg·d) PHPS1，對照組給予腹腔注射同等劑量0.9% NaCl溶液，同時喂養西方膳食飼料(1.25%膽固醇、7%脂肪、其余為基礎飼料)16周，以構建AS模型。實驗中期每組死亡1只小鼠，實驗結束后，取出主動脈根部存于福爾馬林中，固定后石蠟包埋，制備連續切片，用于Movat染色、天狼星紅染色、免疫組化和免疫熒光雙染色；整條降主動脈浸入液氮中，研磨提取蛋白后于-80 ℃冰箱保存。

1.3 Movat及天狼星紅染色每個主動脈根部標本切片30張，每間隔6張切片選取1張分別做Movat、天狼星紅染色。Movat染色分別經過阿爾新藍染色細胞外基質，乙醇氨水返藍，鐵蘇木素染色動脈彈力板，比布列希猩紅染色血管平滑肌，乙醇藏紅花染斑塊內膠原成分；天狼星紅染色特異性評估膠原成分，天狼猩紅-苦味酸飽和溶液染30 min, 無水乙醇分化脫水, 中性樹膠封片，顯微鏡下觀察拍照。

1.4 免疫組化染色將石蠟切片放置于65 ℃恒溫箱中烘烤2 h，依次經過脫蠟、水化后置于3%的H2O2中以消除內源性過氧化物酶的活性，用蒸餾水沖洗2～3次，5 min/次, 將切片放入盛有pH值6.0檸檬酸緩沖液的容器中，置于90～95 ℃的微波爐中加熱25～30 min，修復結束后取出容器，冷卻至室溫，用正常山羊血清室溫封閉孵育30 min后加入一抗CD68 (1 ∶100)孵育4 ℃過夜，第二天PBS沖洗3次，5 min/次，洗去未結合抗體的后，加入山羊抗兔 IgG H&L (HRP) 的二抗室溫孵育45 min，用PBS沖洗3次，5 min/次，然后DAB顯色、蘇木精復染細胞核、常規脫水、透明后中性樹膠封片，自然晾干后使用Carl zeiss顯微鏡采圖后，經使用Image Pro Plus 6.0測算斑塊面積、分析組化染色光密度值，觀察動脈粥樣硬化斑塊內單核巨噬細胞的陽性面積。

1.5 免疫熒光染色將切片放于恒溫烤箱中烘烤2 h，依次經梯度乙醇脫蠟后，用免疫組化筆在標本附近畫一個圓圈，滴加3%的H2O2，室溫封閉30 min，取出切片放入TBS中沖洗3次，5 min/次，甩干切片，滴加2 % BSA 封閉液室溫封閉2 h，加入一抗CD68(1 ∶50)、MMP-9(1 ∶80)置于濕盒內4 ℃過夜；第二天取出濕盒，平衡至室溫，用TBS沖洗3次，5 min/次，加入山羊抗鼠IgG H&L(Alexa Fluor?488)預吸附二抗，室溫避光孵育45 min后TBS沖洗3次，5 min/次，加入DAPI封片，蓋上蓋玻片，避免氣泡，全程避光，倒置熒光顯微鏡下觀察，并采集圖像。

1.6 Westen blot實驗將主動脈蛋白提取，將主動脈放入研磨皿中研磨，加入蛋白裂解液500 μl、5 μl PMSF、蛋白酶磷酸酶抑制劑5 μl混合物，在冰上充分研磨30 min后4 ℃，12 000 r/min離心10 min，取上清液置于1.5 ml EP管中，按照BCA蛋白試劑盒操作測定蛋白濃度，按4：1的 比例加入 5×上樣緩沖液，煮沸10 min，-20 ℃保存備用。10 %聚丙烯酰胺SDS-PAGE電泳120 V，60 min，PVDF膜半干式轉膜300 mA，90 min后，封閉PVDF膜過夜，TBST緩沖液充分震蕩洗膜，一抗(ERK/p-ERK和MMP-9濃度均為1 ∶1 000)，4 ℃過夜孵育后，TBST震蕩洗脫未結合的一抗2 h，加入二抗(1 ∶2 000)室溫孵育2 h，TBST緩沖液搖床震蕩洗膜，ECL發光液曝光。

2 結果

2.1 小鼠主動脈根部斑塊面積大小與對照組相比，PHPS 1處理組主動脈根部斑塊面積大小有差異(F=3.703,P<0.01)。見圖1。

圖1 兩組小鼠主動脈根部Movat染色評估斑塊 ×40與對照組比較：**P<0.01

2.2 斑塊內膠原成分結果顯示，與對照組相比，實驗組PHPS1斑塊內膠原成分含量增加(F=2.702,P<0.01)。見圖2。

圖2 主動脈根部切片天狼星紅染色評估膠原成分 ×40與對照組比較：**P<0.01

2.3 斑塊內容物評估對照組和實驗組斑塊內巨噬細胞成分陽性面積/斑塊面積分別為：(0.799±0.031)、(0.621±0.043)，實驗組小鼠主動脈斑塊內巨噬細胞陽性面積減少(F=1.911,P<0.01)。見圖3；免疫熒光雙染可見實驗組抑制了巨噬細胞(CD 68)分泌的MMP-9的表達量，MMP-9熒光強度減弱(F=1.117,P<0.01)。見圖4。

圖3 兩組小鼠主動脈根部切片巨噬細胞(CD68)免疫組化染色 ×40與對照組比較：**P<0.01

圖4 免疫熒光檢測小鼠主動脈根部CD68及MMP-9的表達 ×100與對照組比較：**P<0.01

2.4 Western blot檢測降主動脈內蛋白水平實驗結果顯示，經過PHPS1處理后的小鼠降主動脈內ERK活性下降(F=1.222,P<0.01)，同時伴隨著其調控的下游MMP-9蛋白表達量也降低(F=37.49,P<0.01)。見圖5。

圖5 Western blot檢測小鼠降主動脈內ERK/p-ERK、MMP-9蛋白表達水平與對照組比較:**P<0.01

3 討論

蛋白酪氨酸磷酸酶(protein tyrosine phosphatase, PTPase) SHP-2主要通過調控細胞外調節蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases, ERK)包括ERK1和ERK 2(total ERK1/2)發揮作用，是參與AS進程的關鍵蛋白之一[4-6]。動脈粥樣硬化的發展程度取決于斑塊的大小、穩定性，穩定性決定了動脈管壁的狀態，斑塊不穩定是由于纖維帽的連續性差，厚度薄，當血流沖擊時，易引起不穩定的斑塊脫落，導致嚴重的臨床后果[7-9]。斑塊的纖維帽主要是由膠原構成的，膠原可以抵抗血流對血管壁的沖擊，也可以保護斑塊的完整性。在動脈粥樣硬化的發展中，單核細胞遷移到血管內皮，分化為易損斑塊中的巨噬細胞[10-12]，巨噬細胞分泌基質金屬蛋白酶(MMPs)，可以降解不穩定斑塊的纖維帽， MMP-9是MMPs的一種， MMP-9活性升高，可加速細胞外基質降解，降低動脈粥樣硬化斑塊的穩定性，加速斑塊破裂的速度，加重AS的進展[13]。

ERK通路是參與AS進程發展的蛋白之一，也是調控基質金屬蛋白酶(MMP-9)分泌的關鍵[13]。由于SHP-2是蛋白酪氨酸磷酸酶家族的一員[14]，其主要是通過調控ERK蛋白活性而達到不同的生物學作用[3-5]。PHPS1可以特異性地結合SHP-2的生物活性區域，進而順利打入細胞內部，所以是理想的SHP-2抑制劑[15]。該研究以3 mg/(kg·d) PHPS1腹腔注射ApoE-/-小鼠來觀察SHP-2在AS中的作用，以斑塊大小/動脈總面積代表動脈的堵塞或者狹窄程度。結果表明PHPS1處理后可影響小鼠主動脈根部斑塊的面積，斑塊面積減小。斑塊內膠原成分的含量是評估斑塊穩定性的重要因素之一，膠原是構成纖維帽的主要成分，經過天狼星紅特異性病理染色觀察斑塊內膠原含量，顯示PHPS1組小鼠主動脈根部切片斑塊內纖維帽連續性較好并且厚度增加，提示PHPS1可以穩定斑塊。AS斑塊主要由平滑肌和巨噬細胞構成，其中斑塊內平滑肌是分泌膠原成分的主要細胞，具有增強斑塊穩定性的作用；而巨噬細胞是AS斑塊內最主要的細胞成分，可以分泌多種炎癥因子和MMPs降解膠原成分，促進細胞凋亡，是加速斑塊進展、導致斑塊不穩定的主要的細胞，通過免疫組化染色發現：PHPS1組小鼠主動脈斑塊內巨噬細胞成分陽性面積減少，提示PHPS1具有抑制炎癥的作用。該實驗通過免疫熒光雙染進一步發現CD68標記的巨噬細胞和其分泌的細胞因子MMP-9分布具有一致性，提示PHPS1可能是通過抑制MMP-9的表達進而抑制了膠原的降解。進一步，該實驗通過Western blot進行驗證，結果表明在經PHPS1處理后MMP-9蛋白含量減少，并檢測降主動脈中ERK/p-ERK的活性(磷酸化水平)，結果表明PHPS1抑制了ERK/p-ERK的磷酸化水平，提示其下游的MMP-9的表達量降低，可能是由于ERK的活性被抑制。

綜上所述，該研究表明PHPS1可以通過抑制ERK通路的蛋白活性，降低基質金屬蛋白酶MMP-9的表達，來保持斑塊纖維帽的完整，加強動脈粥樣硬化斑塊的穩定性，所以該實驗結果提示SHP-2的活化能夠導致易損斑塊不穩定性增強。該研究表明SHP-2調控ERK/P-ERK通路而影響MMP-9的表達及活性，可為AS進一步臨床研究提供研究方向、思路及相對客觀理論依據。