慢病毒介導沉默NIPBL基因對小鼠骨髓間充質干細胞成骨分化能力的影響

姜德坤，張惠榮，潘金勇，馬雯晴，劉 輝，董麗麗

德朗熱綜合征(Cornelia de Lange syndrome，CdLS)是一種以生長發育遲緩、嚴重認知障礙、特征性面容、肢體發育畸形為特點的遺傳性疾病[1]。NIPBL基因為主要致病基因[2]，其表達水平越低則病情越嚴重，在CdLS診斷中首要檢測指標是確定NIPBL基因是否突變[3]。研究[4]表明其肢體發育畸形發生率高達73.1%。前期研究[5]表明NIPBL基因低表達會抑制shh、Wnt5a基因及其蛋白的表達，從而影響Wnt信號通路相關分子的表達。推測NIPBL基因可能通過Wnt信號通路調控骨髓間充質干細胞的成骨分化，但其具體機制尚未見報道。該研究用慢病毒轉染小鼠骨髓間充質干細胞沉默NIPBL基因，探究成骨相關基因骨形態發生蛋白2(bone morphogenetic protein 2，BMP-2)、骨鈣素(osteocalcin，OCN)、Runt相關轉錄因子2(runt-related transcription factor 2，RUNX-2)的表達，以揭示NIPBL基因對骨髓間充質干細胞成骨分化相關基因表達的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗對象原代小鼠骨髓間充質干細胞購于武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.2 試劑與儀器DMEM/F-12培養基(美國gibco公司)；胎牛血清(美國Hyclone公司)；反轉錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒(美國Thermo公司)；CCK-8試劑盒(上海東仁化學科技有限公司)；堿性磷酸酶試劑盒(美國Cyagen公司)；RUNX2抗體、BMP2抗體、Osteocalcin抗體(英國Abcam公司)；β-actin抗體、辣根過氧化物酶標記的二抗(武漢博士德生物工程有限公司)；慢病毒(上海吉瑪基因公司)；倒置相差熒光顯微鏡(日本Nicon公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1NIPBL基因慢病毒載體構建 針對NIPBL目標基因序列，設計3條NIPBL-siRNA，分別為siRNA1:5′-GCAGATGCCTGTCTTACAACT-3′; siRNA2: 5′-GCATCCGAGTCTAATGTTTGA-3′;siRNA3:5′-GC AGGATACATGCCATATTCC-3′。陰性對照序列為：5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′。慢病毒載體的構建由上海吉瑪基因股份有限公司完成。

1.3.2慢病毒轉染預實驗 接種細胞于96孔培養板中培養，設置感染復數(multiplicity of infection,MOI)為10、30、60、100。轉染后72 h在相差熒光顯微鏡下觀察結果(圖1)。轉染效率的測定：在200倍視野下均勻測定10個視野的細胞總數和帶熒光細胞數，細胞轉染效率=10個視野內帶熒光細胞總數/細胞總數。當MOI=60時，細胞轉染效率達94%，設為最適感染復數。

圖1 不同MOI轉染結果(倒置相差熒光顯微鏡 ×100)A：MOI=10；B：MOI=30；C：MOI=60；D：MOI=100

1.3.3慢病毒轉染 該實驗分為5組：① siRNA1組：用攜帶NIPBL-siRNA1的慢病毒載體轉染細胞；② siRNA2組：用攜帶NIPBL-siRNA2的慢病毒載體轉染細胞；③ siRNA3組：用攜帶NIPBL-siRNA3的慢病毒載體轉染細胞；④ 陰性對照組：用攜帶陰性對照的慢病毒載體轉染細胞；⑤ 空白對照組：不添加慢病毒載體，其他操作步驟與前各組相同。設置MOI=60，轉染72 h后觀察結果。提取各組細胞RNA，通過qRT-PCR檢測轉染后NIPBL基因的mRNA表達量，NIPBL、BMP-2、OCN、RUNX-2和內參基因β-actin引物由生工生物工程(上海)有限公司設計與合成，引物序列見表1。PCR反應體系(20 μl)：cDNA 2 μl、上下游引物各1 μl、2×PowerUp SYBR Green Master Mix 10 μl、ddH2O 6 μl。反應條件：50 ℃、2 min，95 ℃、2 min；95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，40個循環。采用2-ΔΔCt法計算NIPBL基因的mRNA相對表達量，確定各組的抑制效率，抑制效率=(空白組表達量-siRNA組表達量)/空白組表達量，選擇抑制效率最高的siRNA進行后續實驗。

表1 NIPBL、β-actin、 BMP-2、 OCN 、RUNX-2引物信息

1.3.4轉染后細胞增殖能力檢測 取三組細胞接種于96孔板中培養。在第1、3、5、7、9天的同一時間加入CCK-8試劑，放入培養箱中培養2 h后，用酶標儀檢測450 nm波長吸光度值(optical density，OD)，以時間為橫坐標，OD值為縱坐標，繪制細胞的生長曲線。

1.3.5誘導成骨分化 取三組細胞于6孔板中培養。當細胞融合度達到70%時，更換培養基為成骨誘導分化完全培養基(含基礎培養基175 ml、專用血清20 ml、雙抗2 ml、地塞米松20 μl、抗壞血酸400 μl、β-甘油磷酸鈉2 ml、谷氨酰胺2 ml)，每隔3 d更換培養基。

1.3.6檢測堿性磷酸酶活性 分別于成骨誘導的第5、7、10、14天收集細胞培上清液，按照說明書進行檢測，使用酶標儀測定520 nm波長OD值。

1.3.7qRT-PCR檢測BMP-2、OCN、RUNX-2基因的mRNA表達量 在成骨誘導的第7、14、21天，分別提取3組細胞的總RNA，反轉錄后，通過qRT-PCR檢測BMP-2、OCN、RUNX-2基因的mRNA表達量。反應體系及條件同上文所述。采用2-ΔΔCt法計算BMP-2、OCN、RUNX-2基因的mRNA相對表達量。

1.3.8Western blot檢測OCN、BMP-2、RUNX-2基因的蛋白表達水平 在成骨誘導的第7、14、21天，提取各組細胞總蛋白，BCA法檢測蛋白濃度。加入5×buffer配平后煮沸變性進行電泳，轉膜。使用雙蒸水浸泡3 min、1×電轉液浸泡12 min活化NC膜。室溫搖床上封閉3 h，各自加入β-actin(1 ∶400)、Runx2(1 ∶2 000)、OCN(1 ∶2 000)、BMP2(1 ∶2 000)一抗，于4 ℃冰箱搖床孵育過夜。用TBST洗膜3次后，加入二抗(1 ∶20 000)室溫搖床孵育2 h，用TBST洗膜3次后，加發光試劑(ECL)顯色后掃描，使用ImageJ軟件進行分析灰度值，目的蛋白表達量=目的蛋白灰度值/β-actin蛋白灰度值。

1.3.9茜素紅染色分析 在成骨誘導21 d后，PBS沖洗2次，中性甲醛固定30 min，PBS沖洗2次，茜素紅染液染色5 min，PBS沖洗3次，倒置相差顯微鏡下觀察染色結果。再加入10%氯化十六烷基吡啶脫色30 min，每組取3個重復樣本，使用酶標儀檢測570 nm波長OD值。

2 結果

2.1 慢病毒轉染結果及抑制效率慢病毒轉染后，siRNA1組、siRNA2組、siRNA3組和陰性對照組可見大量熒光，空白對照組無熒光(圖2)。siRNA1組、siRNA2組、siRNA3組、陰性對照組、空白對照組NIPBL基因的mRNA相對表達量為(0.498±0.015)、(0.589±0.250)、(0.301±0.025)、(1.039±0.214)、(1.000±0.011)，陰性對照組與空白對照組的NIPBL基因的mRNA表達量差異無統計學意義(P>0.05)，siRNA1組、siRNA2組、siRNA3組的抑制效率分別為51%、42%、70%。NIPBL-siRNA3抑制效率最佳，用其進行后續實驗。

圖2 倒置相差熒光顯微鏡下各組慢病毒轉染結果 ×100A：siRNA1組；B：siRNA2組；C：siRNA3組；D：陰性對照組；E：空白對照組

2.2 轉染后細胞增殖能力比較實驗組和陰性對照組及空白對照組在前5天差異無統計學意義，在第6天后，陰性對照組與空白對照組細胞增殖能力提高，實驗組增殖能力增加緩慢，陰性對照組與空白對照組差異無統計學意義。見圖3。

圖3 各組細胞的生長曲線

2.3 堿性磷酸酶活性比較隨著時間增加，各組細胞堿性磷酸酶活性均增加，實驗組堿性磷酸酶活性在第5天時與陰性對照組和空白對照組無差異，在6 d后各時間點較陰性對照組和空白對照組低，差異有統計學意義(P<0.05)。陰性對照組與空白對照組之間，差異無統計學意義。見圖4。

圖4 各組細胞的堿性磷酸酶活性與陰性對照組比較：*P<0.05；與空白對照比較：#P<0.05

2.4BMP-2、OCN、RUNX-2基因的mRNA表達量實驗組BMP-2、OCN、RUNX-2基因的mRNA表達量在第7、14及21天均低于陰性對照組和空白對照組，且差異有統計學意義(P<0.05)。陰性對照組和空白對照組在各時間點表達量無差異。見圖5。

圖5 BMP-2、OCN、RUNX-2基因的mRNA表達量A: BMP-2基因; B：OCN基因；C：RUNX-2基因

2.5OCN、BMP-2、RUNX-2基因的蛋白表達水平實驗組BMP-2、OCN、RUNX-2基因的蛋白表達量在第7、14及21天均低于陰性對照組和空白對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，陰性對照組和空白組在各時間點，蛋白表達量差異無統計學意義。OCN基因的蛋白表達量在第7、14天無變化，第21天時表達量增加。BMP-2、RUNX-2基因的蛋白表達量均隨時間增加而增加，在第21天表達量最多。見圖6。

圖6 各組中OCN、BMP-2、RUNX-2基因的蛋白表達水平A:第7天；B:第14天；C:第21天；

2.6 茜素紅染色結果成骨誘導分化的第21天，按照說明書進行茜紅素染色后觀察結果，實驗組鈣結節低于陰性對照組和空白對照組(P<0.05)，陰性對照組和空白對照組差異無統計學意義。見圖7。

圖7 倒置相差顯微鏡下茜素紅染色結果 ×400A：實驗組；B：陰性對照組；C：空白對照組

3 討論

CdLS作為一種遺傳異質性疾病，具有廣泛的表型變異性，從輕度到重度具有不同程度的面部、肢體畸形。CdLS發病主要與粘蛋白復合體相關的基因突變有關，其中以NIPBL基因突變為主，且有研究[6]表明NIPBL基因突變所致CdLS患者有更嚴重的面部、肢體骨骼發育畸形。有研究[7]表明在S期、G1期和G2期，NIPBL基因參與調控將黏蛋白復合物加載到染色質上的過程。因此NIPBL基因突變引起基因表達調節的異常從而導致CdLS的發生，目前公認為NIPBL基因是CdLS的最重要的致病基因，但是其具體分子機制尚不明確,因此研究NIPBL基因對成骨分化的調控機制具有重要意義。

慢病毒載體可以將外源基因有效的整合到宿主染色體上，從而達到持久性的表達[8]。因此，該實驗采取慢病毒載體將目的基因轉染到小鼠骨髓間充質干細胞。該實驗通過慢病毒轉染抑制NIPBL基因表達，抑制效率達70%。通過CCK-8法檢測轉染后細胞增殖能力：空白對照組和陰性對照組的細胞增長曲線沒有明顯差異，實驗組細胞增殖能力降低。PCR檢測轉染后NIPBL基因表達情況：空白對照組與陰性對照組無明顯差異，實驗組表達量約為空白對照組的30%。以上實驗結果說明慢病毒載體不會影響細胞生長，且能使目的基因有效表達。

堿性磷酸酶是早期反映細胞成骨分化水平的重要標志物[9]。該實驗在成骨誘導過程中，堿性磷酸酶活性隨著時間而逐漸增加，在第5天后，實驗組堿性磷酸酶活性明顯低于陰性對照組和空白對照組。RUNX-2是成骨誘導分化過程中關鍵的一個轉錄因子，是骨形成的過程中較早和具有明顯特征性的標志物之一[10]。OCN是成骨分化的特異性基因，形成骨基質中的主要非膠原成分，調節控制礦物質形成的方向和速度[11]。BMP-2是一種酸性糖蛋白，在調控骨形成發育中起著重要作用[12]。該實驗結果顯示：在成骨誘導的第7、14、21天，實驗組BMP-2、OCN、RUNX-2的mRNA和蛋白表達量均低于陰性對照組和空白對照組，說明通過慢病毒轉染沉默NIPBL基因后，成骨相關基因的表達受到抑制。茜素紅染色結果反映成骨分化晚期的鈣鹽沉積情況，該實驗顯示在成骨誘導21天后實驗組、陰性對照組和空白對照組均出現鈣鹽沉積，但實驗組明顯少于空白對照組和陰性對照組。有研究[13]表明ALP、RUNX-2可反映早期的成骨狀態，BMP-2、OCN可以反映晚期的成骨狀態。該實驗結果明確轉染后實驗組ALP、RUNX-2、BMP-2、OCN的表達均下降，表明NIPBL基因在調控成骨分化過程中發揮一定作用。

課題組前期研究[5]表明敲除NIPBL基因后Wnt5a基因的表達水平受到抑制，Wnt5a是Wnt信號通路的一個重要因子，且能與ROR蛋白結合，以調節成骨和軟骨的形成，從而調控肢體發育形態。Wnt/β-catenin信號通路在成骨過程中發揮作用，而OCN、RUNX-2是該信號通路的靶基因[14]。該研究顯示，用慢病毒沉默NIPBL基因后，小鼠骨髓間充質干細胞的增殖能力和成骨分化能力會減弱，其機制可能是通過Wnt/β-catenin信號通路調控成骨的過程。由此推測CdLS患者的骨骼發育異常可能與Wnt信號通路的下調有關，其具體調控機制仍待進一步研究。