lncRNA PITPNA-AS1靶向miR-92a-3p/TCF21對卵巢癌OVCAR-3細胞增殖和侵襲的影響

曾 潔，曾友玲，張 清，陳 說，楊 玉，馬元學

卵巢癌是一種常見的婦科惡性腫瘤，病死率居婦科腫瘤首位，其發病率近年來呈現上升趨勢[1]。卵巢癌的治療方式主要包括外科手術治療和化療，醫療技術的進步盡管改善了卵巢癌患者的預后，但其五年生存率依然很低，嚴重威脅女性生命健康[2]。因此，尋找新的卵巢癌早期診斷標志物和分子治療靶標對改善患者的預后具有重要意義。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一種轉錄本長度大于200個核苷酸的非編碼RNA[3]。lncRNA可在轉錄水平或者轉錄后水平影響基因的表達，調控細胞分化、凋亡、衰老等各種生物學行為[4]。越來越多的研究[5]表明，lncRNA在多種腫瘤如卵巢癌、鼻咽癌、甲狀腺癌、肝癌等中表達異常，在腫瘤的發生、發展過程中扮演重要角色。研究[6- 7]顯示，lncRNA PITPNA-AS1定位于細胞質，可影響肝癌、肺癌、宮頸癌細胞的增殖、細胞周期、轉移、凋亡等。卵巢癌中關于PITPNA-AS1的報道很少。該研究通過檢測卵巢癌組織和細胞系中PITPNA-AS1的表達水平，觀察過表達PITPNA-AS1后卵巢癌細胞增殖活力和侵襲能力，并進一步預測和驗證PITPNA-AS1作用的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1組織標本 收集2018年6月—2020年8月在華中科技大學同濟醫學院附屬武漢兒童醫院(武漢市婦幼保健院)婦科接受手術治療的42例卵巢癌患者的癌組織和癌旁組織。患者年齡38～74(56.42±9.13)歲。組織于液氮罐中保存，所有組織均由該院病理科醫師確認，癌組織類型均為漿液性囊腺癌，高分化19例，中低分化23例。國際婦產科聯盟(International Federation of Gynecology and Obstetrics，FIGO)分期為Ⅰ期+Ⅱ期28例、Ⅲ期+Ⅳ期14例。該研究經華中科技大學同濟醫學院附屬武漢兒童醫院醫學倫理委員會審核通過，患者均簽署知情同意書。

1.1.2 細胞與試劑人卵巢癌細胞系(HO-8910、A2780、SKOV-3、OVCAR-3、OC3)和正常卵巢上皮細胞系IOSE80均購自中國科學院上海細胞庫。miR-92a-3p mimics、miR-NC、PITPNA-AS1過表達質粒、陰性對照質粒、PITPNA-AS1-WildType-Reporter(WT)載體、PITPNA-AS1-Mut-Reporter(Mut)載體、TCF21-WildType-Reporter(WT)載體、TCF21-Mut-Reporter(Mut)載體購自上海吉瑪公司。DMEM/F12培養基、胎牛血清(FBS)、RPMI 1640培養基購自美國Hyclone公司。Transwell小室購自美國康寧公司。TRIzol試劑盒、Lipofectamine 3000轉染試劑盒、Matrigel基質膠購自美國Invitrogen公司。細胞計數實驗(cell count kit-8，CCK-8)試劑盒購自大連美侖生物技術有限公司。qPCR試劑盒、RNA逆轉錄試劑盒購自美國Roche公司。雙熒光素酶報告基因試劑盒和一抗(TCF21、CDK6、β-Tubulin、Cyclin D2、Zeb2、Snail)均購自美國Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1細胞培養和轉染 常規復蘇OVCAR-3、OC3細胞后培養于含10% FBS的RPMI 1640培養基，常規復蘇HO-8910、A2780、SKOV-3、IOSE80細胞后培養于含10% FBS的DMEM/F12培養基，在37 ℃、5%體積分數CO2的培養箱中培養。將對數生長期的OVCAR-3細胞接種于6孔板，細胞匯合度為50%時，采用脂質體轉染技術將PITPNA-AS1或陰性對照質粒轉染進OVCAR-3細胞，記為實驗組和對照組，轉染方法依據Lipofectamine 3000說明書嚴格操作。收集轉染48 h后的細胞用于后續實驗。

1.2.2熒光實時定量聚合酶鏈反應(qPCR) 采用TRIzol法提取組織或細胞中總RNA，超微量分光光度計檢測RNA的純度及濃度，采用逆轉錄試劑盒逆轉錄RNA為cDNA。建立qPCR擴增體系，qPCR引物序列：PITPNA-AS1上游引物為 5′-GCAGGGTGGATAAAGAGGA-3′，下游引物為5′-CCTACTGACAGGATGTCCT-3′；GAPDH上游引物為 5′-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3′，下游引物為5′-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3′；TCF21上游引物為 5′-TCCTGGCTAACGACAAATACGA-3′，下游引物為5′-TTTCCCGGCCACCATAAAGG-3′；U6上游引物為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物為5′-ACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；miR-92a-3p上游引物為 5′-UAUUGCACUGUCCCGGCCUGU-3′，下游引物為5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′。采用2-ΔΔCt法處理數據，以GAPDH為內參分析PITPNA-AS1和TCF21 mRNA的表達水平，以U6為內參分析miR-92a-3p的表達水平。

1.2.3CCK-8檢測OVCAR-3細胞的增殖活性 將轉染后的各組OVCAR-3細胞接種于96孔板(3 000個/孔)，200 μl/孔培養基，分別培養1、2、3、4、5 d，在每個時間點分別進行CCK-8法檢測時，每孔中加入20 μl CCK-8試劑，在暗箱中繼續培養2 h，在酶標儀上測定450 nm波長處每孔的吸光度(A)值，以A值代表細胞的增殖活性。

1.2.4Transwell實驗檢測OVCAR-3細胞的侵襲能力 預鋪Matrigel基質膠至Transwell小室上層，在培養箱中凝固。胰酶消化收集轉染后的OVCAR-3細胞，無血清培養基制備單細胞懸液，接種于Transwell小室上層(2×104個/孔)，每孔200 μl培養基。在Transwell小室下層加600 μl含血清培養基。在培養箱中培養24 h，取出Transwell小室，4%多聚甲醛固定20 min，0.1%結晶紫溶液染色20 min。流水沖洗后，采用棉簽擦去未穿膜的OVCAR-3細胞。室溫下風干后，在光學顯微鏡下對侵襲細胞數計數。

1.2.5生物信息學方法預測PITPNA-AS1作用的分子機制 使用starBase v2.0網站預測PITPNA-AS1可相互作用的微小RNA(miRNA)。使用DIANA-microT網站預測miRNA的靶基因。

1.2.6雙熒光素酶報告基因實驗 將PITPNA-AS1-WT、PITPNA-AS1-Mut質粒分別與miR-NC、miR-92a-3p共轉染至OVCAR-3細胞中，根據雙熒光素酶報告基因試劑盒說明書操作，48 h后用化學發光技術測定每組細胞的相對熒光素酶活性，驗證miR-92a-3p靶向結合并受PITPNA-AS1調控。將TCF21-WT、TCF21-Mut質粒分別與miR-92a-3p、miR-NC共轉染至OVCAR-3細胞中，根據雙熒光素酶報告基因試劑盒說明書操作，48 h后用化學發光技術測定每組細胞的螢火蟲熒光素酶活性和海腎熒光素酶活性，相對熒光素酶活性=螢火蟲熒光素酶活性/海腎熒光素酶活性，驗證miR-92a-3p靶向結合并可調控TCF21。

1.2.7Western blot檢測 在各組細胞中加入1 ml RIPA 裂解液，冰上裂解 30 min，收集上清液并采用BCA蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度。每孔道加等量蛋白，進行十二烷基聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜后用5%脫脂牛奶封閉3 h，加入均以1 ∶1 000比例稀釋的一抗，在冰箱內孵育過夜。加入以1 ∶10 000比例稀釋的二抗孵育3 h，滴加ECL溶液，在化學發光成像系統內顯影、拍照，以β-tubulin為內參蛋白。采用Image-Pro Plus 4.0軟件比較蛋白的相對表達水平。

2 結果

2.1 PITPNA-AS1在卵巢癌組織和細胞系中低表達該研究結果顯示，PITPNA-AS1在卵巢癌組織相對表達低于癌旁組織相對表達，差異有統計學意義(t=14.81，P<0.01)，見圖1。與正常卵巢上皮IOSE80細胞相比，PITPNA-AS1在人卵巢癌細胞系(HO-8910、A2780、SKOV-3、OVCAR-3、OC3)中低表達(P<0.05)，見圖2，以OVCAR-3細胞中PITPNA-AS1的表達最低(P<0.01)，所以后續實驗選該細胞系。

圖1 PITPNA-AS1在卵巢癌組織和癌旁組織中的表達與癌旁組織比較：**P<0.01

圖2 PITPNA-AS1在正常卵巢上皮細胞和卵巢癌細胞系中的表達與IOSE80細胞比較：*P<0.05，**P<0.01

2.2 轉染PITPNA-AS1過表達質粒對OVCAR-3細胞中PITPNA-AS1的表達的影響該研究顯示，PITPNA-AS1在對照組和實驗組OVCAR-3細胞中相對表達分別為(1.01±0.07)和(12.12±2.54)，差異有統計學意義(P<0.01)，提示PITPNA-AS1質粒可有效提高OVCAR-3細胞中PITPNA-AS1的表達，表明轉染成功。

2.3 過表達PITPNA-AS1對OVCAR-3細胞增殖活性的影響CCK-8法檢測顯示(圖3)，接種2 d后，對照組OVCAR-3細胞吸光度高于實驗組OVCAR-3細胞(P<0.05)，表明過表達PITPNA-AS1能抑制OVCAR-3細胞增殖活性。

圖3 過表達PITPNA-AS1對OVCAR-3細胞增殖活性的影響與對照組比較：*P<0.05，**P<0.01

2.4 過表達PITPNA-AS1對OVCAR-3細胞的侵襲能力影響Transwell實驗顯示(圖4)，對照組穿膜細胞數個/視野多于實驗組穿膜細胞數，差異有統計學意義(P<0.01)，表明過表達PITPNA-AS1能抑制OVCAR-3細胞的侵襲能力。

圖4 過表達PITPNA-AS1表達對OVCAR-3細胞侵襲能力的影響 結晶紫染色 ×100與對照組比較：**P<0.01

2.5 生物信息學方法預測PITPNA-AS1作用的分子機制如圖5，使用starBase v2.0網站預測顯示，miR-92a-3p可以與PITPNA-AS1的互補序列結合。使用DIANA-microT網站預測顯示，TCF21 mRNA可以與miR-92a-3p中互補序列結合。

圖5 PITPNA-AS1互補結合miR-92a-3p的序列區域及miR-92a-3p互補結合TCF21 mRNA的序列區域

2.6 雙熒光素酶報告基因實驗如圖6，共轉染PITPNA-AS1-WT與miR-92a-3p后相對熒光素酶強度較PITPNA-AS1-WT與miR-NC降低(P<0.01)，定點突變后，共轉染PITPNA-AS1-Mut與miR-92a-3p較PITPNA-AS1-Mut與miR-NC相對熒光素酶活性差異無統計學意義，表明PITPNA-AS1能夠靶向結合miR-92a-3p。如圖6，共轉染TCF21-WT與miR-92a-3p后相對熒光素酶強度較TCF21-WT與miR-NC降低(P<0.01)，定點突變后，共轉染TCF21-Mut與miR-92a-3p較TCF21-Mut與miR-NC相對熒光素酶活性差異無統計學意義，表明TCF21能夠靶向結合miR-92a-3p。

圖6 雙熒光素酶報告基因實驗驗證PITPNA-AS1作用的分子機制A：PITPNA-AS1與miR-92a-3p的靶向關系驗證；B：miR-92a-3p與TCF21的靶向關系驗證;與miR-NC比較：**P<0.01

2.7 過表達PITPNA-AS1的OVCAR-3細胞中miR-92a-3p和TCF21 mRNA的表達情況本研究顯示，對照組OVCAR-3細胞中miR-92a-3p相對表達(1.02±0.10)高于實驗組相對表達(0.35±0.09)，差異有統計學意義(P<0.01)；對照組OVCAR-3細胞中TCF21 mRNA相對表達(1.09±0.24)低于實驗組相對表達(6.79±1.31)，差異有統計學意義(P<0.01)，表明過表達PITPNA-AS1能下調miR-92a-3p的表達，增加TCF21 mRNA的表達。

2.8 過表達PITPNA-AS1的OVCAR-3細胞中TCF21蛋白的表達該研究采用Western blot檢測結果顯示(圖7)，過表達PITPNA-AS1后，TCF21蛋白表達增加，細胞增殖相關蛋白CDK6、Cyclin D2表達降低，細胞侵襲相關Zeb2、Snail表達降低，間接表明卵巢癌細胞的增殖和侵襲被抑制。

圖7 過表達PITPNA-AS1對OVCAR-3細胞TCF21蛋白表達的影響與對照組比較：**P<0.01

3 討論

lncRNA在細胞中廣泛存在，參與調控各種信號通路，lncRNA的異常表達與心血管疾病、自身免疫病、腫瘤等多種疾病的發生有關[8]。TPT1-AS1[3]、FAM83H-AS1[5]、KCNQ1OT1[8]等lncRNA已被研究證實可影響卵巢癌細胞的增殖、遷移、凋亡、侵襲等生物學行為，在卵巢癌的發生、發展中起到重要作用。Ren et al[7]研究發現，PITPNA-AS1在非小細胞肺癌組織和細胞系中高表達，沉默PITPNA-AS1可抑制非小細胞肺癌細胞的增殖和轉移能力，并促進細胞凋亡。同一個lncRNA在不同的腫瘤中可發揮不同的作用，既可表現為癌基因作用，也可表現為抑癌基因作用[9]。PITPNA-AS1在卵巢癌中的表達和功能尚不明確。該研究結果表明，與癌旁組織和正常卵巢上皮細胞系比較，PITPNA-AS1在卵巢癌組織和細胞系中的表達降低，提示PITPNA-AS1可能參與卵巢癌的發生和發展。該研究通過CCK-8、Transwell實驗證實，PITPNA-AS1對卵巢癌OVCAR-3細胞增殖和侵襲具有抑制作用，提示PITPNA-AS1在卵巢癌中表現為抑癌基因作用。

微小RNA(miRNA)是一類長度約為18～24個核苷酸的小分子單鏈RNA，可在轉錄后水平特異性結合靶基因信使RNA(mRNA)的3′非翻譯區，誘導靶基因mRNA降解或者直接抑制其翻譯[10]。lncRNA可通過競爭性結合miRNA促進靶基因mRNA的表達，lncRNA-miRNA-靶基因mRNA是lncRNA發揮功能的重要機制[9]。該研究采用starBase v2.0網站預測顯示，PITPNA-AS1可能互補結合miR-92a-3p。miR-92a-3p是miRNA家族一員。Li et al[11]研究發現，miR-92a-3p在食管鱗狀細胞癌組織和細胞系中高表達，miR-92a-3p可促進食管鱗狀細胞癌細胞的增殖、遷移和侵襲，抑制其凋亡，miR-92a-3p表現為癌基因作用。與正常組織相比，miR-92a-3p在卵巢癌組織中的表達較高[12]。雙熒光素酶報告基因實驗顯示PITPNA-AS1可互補結合miR-92a-3p。過表達PITPNA-AS1后，miR-92a-3p表達降低，提示PITPNA-AS1可能在卵巢癌細胞中競爭性結合miR-92a-3p。

該研究采用DIANA-microT網站預測顯示，miR-92a-3p可能互補結合TCF21 mRNA。TCF21基因定位于染色體6q23-q24，是一種新近發現的抑癌基因[13]。TCF21蛋白屬于基本螺旋環螺旋轉錄因子家族，研究表明TCF21在卵巢癌、胃癌、肺癌、乳腺癌等腫瘤中低表達，過表達TCF21可抑制腫瘤細胞的增殖和轉移[14-15]。該研究雙熒光素酶報告基因實驗顯示miR-92a-3p可互補結合TCF21 mRNA。miR-92a-3p表達下調后，TCF21基因的表達增加，提示miR-92a-3p在卵巢癌細胞中的靶基因是TCF21。TCF21蛋白表達增加后，細胞增殖相關蛋白CDK6、Cyclin D2表達降低，細胞侵襲相關Zeb2、Snail表達降低，間接提示卵巢癌細胞的增殖和侵襲被抑制。

綜上所述，PITPNA-AS1在卵巢癌組織及細胞系中低表達，上調PITPNA-AS1通過競爭性結合miR-92a-3p，增加TCF21基因的表達，從而抑制卵巢癌OVCAR-3細胞的增殖活性和侵襲能力，PITPNA-AS1可能是卵巢癌潛在的診療靶標。