釀酒酵母關鍵節點基因缺損對法尼烯合成的影響

王均華，付聞文，李由然，朱惠霖，徐沙，石貴陽*，張梁，丁重陽，顧正華

1(糧食發酵與食品生物制造國家工程研究中心(江南大學)，江蘇 無錫，214122)2 (江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫，214122)

近些年，釀酒酵母因為自身擁有甲羥戊酸代謝途徑，被廣泛應用在萜類化合物合成的研究中[1-3]。在釀酒酵母中，甲羥戊酸途徑通過轉化前體胞質乙酰輔酶A提供基本五碳單元異戊二烯基焦磷酸和二甲基丙烯焦磷酸去合成萜類化合物前體香葉基焦磷酸、法尼基焦磷酸(farnesyl diphosphate，FPP)和香葉基香葉基焦磷酸。通過過表達甲羥戊酸途徑關鍵限速酶3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶(HMGR-CoA reductase，HMGR)編碼基因(HMG1和tHMG1)或者過表達甲羥戊酸途徑所有基因可以增強甲羥戊酸途徑代謝流，繼而提高萜類化合物的產量[4-6]。為了增強丙酮酸脫氫酶旁路途徑合成前體胞質乙酰輔酶A的能力，通過缺損乙醇脫氫酶(ethanol dehydrogenase，ADH)編碼基因(ADH1,3,4,5,6)和甘油三磷酸脫氫酶(glycerol-3-phosphate dehydrogenase，GPD)編碼基因(GPD1,2)可以減少副產物乙醇和甘油的合成，使更多的碳代謝流流向前體胞質乙酰輔酶A的合成，提高釀酒酵母合成萜類化合物的能力[7-9]。同時，有報道通過缺損檸檬酸合酶(citrate synthase)(CIT2)和蘋果酸合酶(malate synthase)(MLS1)基因減少胞質乙酰輔酶A流向其他細胞器[10-11]。此外，FPP下游途徑也受到眾多研究者的關注，通過啟動子的替換可以降低甾醇合成途徑角鯊烯合酶(squalene synthase)(ERG9)的表達水平，或者通過Erg9P降解的方法去減少FPP流向支路甾醇合成途徑[12-15]。二酰基甘油二磷酸磷酸酶(diacylglycerol pyrophosphate phosphatase)(DPP1)和脂磷酸磷酸酶(lipid phosphate phosphatase)(LPP1)基因主要負責類異戊二烯焦磷酸去磷酸化[16]，通過缺損DPP1和LPP1基因可以弱化FPP轉化合成法尼醇，繼而提高萜類化合物的產量[6, 17-18]。

法尼烯(C15H24)，包括α和β 2種倍型，是一種揮發性較強且不溶于水的油性物質。有報道表明，法尼烯在植物中具有抵御害蟲的能力，在醫藥行業可以作為維生素E生產的前體，在能源行業可以作為石油的替代品[19]。盡管上面描述的代謝操作策略已經被應用于釀酒酵母合成萜類化合物的研究，但卻沒有將所有這些代謝操作策略在同一個宿主菌中進行比較[20-21]。本研究以法尼烯為評價產物，利用基因代謝工程操作去構建不同基因缺損法尼烯合成菌株(圖1)。首先，結合本實驗室前期構建的甲羥戊酸途徑強化菌株，通過染色體多拷貝整合法尼烯合成酶編碼基因增強FPP轉化合成法尼烯的能力。其次，評價缺損乙醇、甘油和法尼醇合成支路關鍵基因和胞質乙酰輔酶A轉運至其他細胞器關鍵基因對法尼烯合成的影響。然后，評估缺損GAL相關基因對GAL啟動子控制基因轉錄水平的影響。最后，將獲得的有效基因缺損操作菌在5 L發酵罐進行補料分批發酵。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌株、質粒和培養基

本實驗所用菌株和質粒信息詳見表1。本實驗所用培養基115 ℃滅菌20 min。LB培養基(g/L)：蛋白胨10，酵母粉5，氯化鈉10；YPD培養基(g/L)：酵母粉10，蛋白胨20，葡萄糖20；發酵培養基(g/L)：酵母粉10，蛋白胨20，葡萄糖20，10%(體積分數)十二烷。固體培養基均加入20 g/L瓊脂粉。氨芐青霉素(ampicillin，Amp)添加終質量濃度為100 μg/mL，用于大腸桿菌轉化菌株的生長和篩選。遺傳霉素(geneticin，G418)、潮霉素B(hygromycin，Hyg B)和硫酸諾爾斯菌素(nourseothricin sulfate，NTC)添加終質量濃度分別為500、500、100 μg/mL，用于釀酒酵母轉化菌株的生長和篩選。

圖1 釀酒酵母法尼烯合成途徑和關鍵支路Fig.1 The biosynthesis pathway and branches of farnesene production in Saccharomyces cerevisiae

表1 本實驗涉及菌株和質粒Table 1 Strains and plasmids used in this study

1.1.2 引物

本研究所用引物見附件1(https://kns.cnki.net/kcms/detail/detail.aspx?dbcode=CAPJ&dbname=CAPJLAST&filename=SPFX20210518004)，所有引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

1.1.3 試驗試劑

本實驗所用PrimeSTARDNA polymerase、pMD-19T simple vector、T4 DNA ligase、DNA marker、快速限制性內切酶SacⅡ，大連TAKARA公司；其他快速限制性內切酶，美國Thermo Fisher Scientific公司；2×TaqPCR Master Mix，杭州寶賽公司；G418、Hyg B和NTC，上海生工公司；Amp、醋酸鋰、PEG3350、色譜級甲醇、色譜級乙腈、法尼烯標準品(HPLC ≥ 90%)，美國Sigma公司；鮭魚精DNA，北京索萊寶科技有限公司；質粒小提取試劑盒、DNA純化試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒，蘇州AXYGEN公司；蛋白胨、酵母粉，OXOID公司；十二烷，上海麥克林生化科技有限公司。

1.1.4 儀器與設備

PCR基因擴增儀和凝膠成像系統，美國Bio-Rad公司；小型高速離心機，美國Thermo Fisher Scientific公司；UV-2100型分光光度計，美國UNICO公司；超低溫冰箱，美國Eppendorf公司；超凈工作臺，蘇州凈化設備有限公司；生化培養箱，上海博訊醫療生物儀器股份有限公司；恒溫搖床，上海知楚儀器有限公司；高壓滅菌鍋，日本SANYO公司；5 L玻璃發酵罐，迪必爾生物工程上海有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 法尼烯合成酶多拷貝表達質粒的構建

法尼烯合成酶多拷貝表達質粒具體構建過程見附件2(https://kns.cnki.net/kcms/detail/detail.aspx?dbcode=CAPJ&dbname=CAPJLAST&filename=SPFX20210518004)。

1.2.2 缺損基因質粒的構建

缺損質粒具體構建過程見附件3(https://kns.cnki.net/kcms/detail/detail.aspx?dbcode=CAPJ& dbname=CAPJLAST&filename=SPFX20210518004)。

1.2.3 重組菌的篩選

本實驗所有線性化的表達質粒均通過醋酸鋰轉化法整合至釀酒酵母染色體。YPD固體培養基添加終質量濃度500 μg/mL G418用于整合法尼烯合成酶編碼基因轉化子篩選；選擇固體培養基用于篩選氨基酸缺陷型標記轉化子篩選。轉化平板放置于30 ℃培養箱，轉化子通過基因組PCR驗證。

1.2.4 重組菌法尼烯合成搖瓶發酵

重組菌于YPD平板劃線，30 ℃培養箱活化2 d。挑單菌落接種于20 mL YPD液體培養基，30 ℃，200 r/min培養18 h。按照初始OD600=0.1轉接至30 mL發酵培養基，30 ℃，200 r/min培養120 h。

1.2.5 補料分批發酵

重組菌于YPD平板劃線，30 ℃培養箱活化2 d。挑單菌落接種于20 mL YPD液體培養基，30 ℃，200 r/min培養18 h作為一級種子液。按照初始1%接種量轉接至50 mL YPD培養基，30 ℃，200 r/min培養18 h作為二級種子液。

補料分批發酵方法：發酵初始裝液量為2 L YPD培養基，十二烷20% (體積分數)，通氣量1 L/(L·min)，溫度30 ℃，添加氨水控制pH=5.5，攪拌轉速400 r/min。補料方式為連續補料，葡萄糖溶液質量濃度為600 g/L。

1.2.6 法尼烯HPLC檢測

本實驗使用ThermoFisher UltiMate 3000高效液相色譜對α-法尼烯進行含量測定。檢測條件：Waters C18色譜柱(4.6 mm×250 mm×5 μm)，紫外檢測波長為232 nm，流動相為90%甲醇、5%乙腈和5%超純水，流速為0.8 mL/min，柱溫為40 ℃，樣品檢測時間為15 min。

1.2.7 發酵上清液HPLC檢測

本實驗使用高效液相色譜對乙醇和甘油進行含量測定。檢測條件：示差檢測器，Shodex糖柱(SC-1011)，流動相為5%稀硫酸溶液，流速為0.8 mL/min，柱溫為50 ℃，樣品檢測時間為25 min。

2 結果與分析

2.1 重組釀酒酵母菌株的構建

2.1.1 多拷貝法尼烯合成酶表達質粒的構建

利用酶切連接的方法獲得Fsso基因多拷貝表達質粒Ts-rso (圖2-A)。質粒酶切產物瓊脂糖電泳分析如圖2-B所示。SacⅡ單酶切質粒Ts-rso，在5.95 kpb和2.71 kbp位置有2條帶(泳道1)；XbaⅠ單酶切質粒Ts-rso，在4.69 kpb和3.97 kbp位置有2條帶(泳道2)；NheⅠ和SalⅠ雙酶切質粒Ts-rso，在1.71 kpb和6.96 kbp位置有2條帶(泳道3)。將質粒Ts-rso送至上海生工測序，序列無堿基突變。說明質粒Ts-rso構建成功。

2.1.2 基因缺損質粒的構建

利用引物605-YAN-U和605-YAN-D菌落PCR篩選(圖2-C，目的條帶605 bp)獲得質粒BTS-ADH3、BTS-ADH4、BTS-ADH5、BTS-ADH6、BTS-GPD1、BTS-GPD2、BTS-GAL1、BTS-GAL7、BTS-GAL10、BTS-CIT2、BTS-MLS1、BTS-BTS1、BTS-LPP1和BTS-DPP1送至上海生工測序，質粒序列無堿基突變。說明上述所有質粒構建成功。

A-質粒Ts-rso物理圖譜；B-質粒Ts-rso酶切驗證；C-菌落PCR驗證圖2 質粒Ts-rso的構建和BTS系列質粒菌落PCR篩選Fig.2 The physic map and verification of plasmid Ts-rso and colony PCR

2.1.3 正確轉化子的篩選

將質粒Ts-rso (限制性內切酶SacⅡ消化)的線性化產物轉化釀酒酵母WHE，在G418抗性YPD平板上篩選轉化子，提取基因組，用引物Fsso-YAN-U和Fsso-YAN-D進行PCR確認(圖3-A)，得到大小為1 700 bp左右的條帶，說明在rDNA位點成功整合Fsso基因，獲得菌株WHE4。

將質粒pHcas9分別與質粒BTS-ADH3、BTS-ADH4、BTS-ADH5、BTS-ADH6、BTS-GPD1、BTS-GPD2、BTS-GAL1、BTS-GAL7、BTS-GAL10、BTS-CIT2、BTS-MLS1、BTS-BTS1、BTS-LPP1和BTS-DPP1轉化釀酒酵母WHE4，在HygB和NTC抗性YPD平板上篩選轉化子，提取基因組，用基因開放閱讀框之外的引物(見表中驗證用引物)進行PCR確認(圖3-B～圖3-G)，獲得不同組合基因缺失菌株WHE4-10、WHE4-13、WHE4-14、WHE4-15、WHE4-21、WHE4-31、WHE4-32和WHE4-33。

A-Fsso基因整合確認；B-ADH3、4、5、6基因缺損確認；C-GPD1基因缺損確認；D-GPD2基因缺損確認；E-GAL1、7、10基因缺損確認；F-CIT2和MLS1基因缺損確認；G-BTS1、DPP1和LPP1基因缺損確認圖3 基因整合和缺損確認Fig.3 PCR verification of integration and deletion

2.2 不同重組菌發酵實驗

2.2.1 多拷貝整合法尼烯合成酶菌株的發酵

隨機挑選轉化平板上47個轉化子，在30 mL發酵培養基中進行發酵實驗并測定法尼烯的產量，結果如圖4所示。從圖4中可以看出不同轉化子法尼烯的產量在235 mg/L左右，選擇菌株WHE4(法尼烯產量為253.24 mg/L)作為接下來研究的出發菌。

圖4 法尼烯合成基因整合菌株法尼烯產量Fig.4 Farnesene production of engineered strains integrated with Fsso

2.2.2 乙醇和甘油積累量的比較

將重組菌WHE4-10、WHE4-14和WHE4-15與WHE4在50 mL YPD培養基中進行搖瓶發酵實驗并測定乙醇和甘油的積累量和OD600，結果如圖5所示，條件1和條件2分別為普通250 mL搖瓶和250 mL擋板搖瓶。菌株WHE4、WHE4-10、WHE4-14和WHE4-15在普通搖瓶中乙醇的最高積累量為8.64、8.77、8.69、8.96 g/L，在擋板搖瓶中乙醇的最高積累量為8.25、8.29、8.36、8.22 g/L，ADH3，ADH4，ADH5和ADH6基因的缺損未能減少乙醇的積累，使用擋板搖瓶進行發酵可以減少乙醇的合成(圖5-A)。菌株WHE4、WHE4-10、WHE4-14和WHE4-15在普通搖瓶中甘油的最高積累量為0.99、0.91、0.85、0.66 g/L，在擋板搖瓶中甘油的最高積累量為1.07、0.98、0.92、0.72 g/L，GPD1和GPD2基因的單缺損可以減少甘油的積累，使用擋板搖瓶進行發酵導致甘油的量上升(圖5-B)。菌株WHE4、WHE4-10、WHE4-14和WHE4-15在普通搖瓶中最高OD600值為5.15、5.14、5.05和5.47，在擋板搖瓶中最高OD600值為5.36、5.35、5.19和5.55，缺損GPD1、GPD2、ADH3、ADH4、ADH5和ADH6基因對菌體的生長幾乎沒有影響，使用擋板搖瓶進行發酵OD600有所上升(圖5-C)。以上結果表明，通過缺損ADH3、ADH4、ADH5和ADH6基因不能減少乙醇的積累量；缺損GPD1和GPD2基因可以減少甘油的積累。

A-乙醇含量的比較；B-甘油含量的比較；C-細胞生長的比較圖5 基因缺損對生長、乙醇含量和甘油含量的影響Fig.5 Cell growth, ethanol and glycerol production of engineered strains

2.2.3 甲羥戊酸途徑轉錄水平的比較

將重組菌WHE4和WHE4-21在50 mL YPD培養基中進行搖瓶發酵實驗并測定甲羥戊酸途徑所有基因轉錄水平變化，結果如圖6所示。與菌株WHE4相比，發酵30 h時，甲羥戊酸途徑ERG10、ERG13、HMG1、ERG12、ERG8、MVD1、IDI1和ERG20基因的轉錄水平均處于下調狀態。以上結果表明，缺損基因GAL1、GAL7和GAL10不能提高甲羥戊酸途徑的強度。與之前研究中報道的缺損GAL1、GAL7和GAL10基因啟動子相比[22]，可能直接缺損GAL1、GAL7和GAL10基因啟動子更加有利于Gal4P與目的GAL啟動子的結合，提高目的基因的表達水平。

圖6 GAL1、GAL7和GAL10基因缺損對甲羥戊酸途徑基因轉錄水平的影響Fig.6 The effects of deletion of GAL1, GAL7 and GAL10 on transcriptional levels of the mevalonate pathway genes

2.2.4 基因缺損菌株法尼烯產量的比較

將重組菌WHE4-10、WHE4-13、WHE4-14、WHE4-15、WHE4-21、WHE4-31、WHE4-22和WHE4-33在30 mL發酵培養基中進行搖瓶發酵實驗并測定法尼烯的產量，結果如圖7所示。菌株WHE4-13、WHE4-14、WHE4-15、WHE4-21和WHE4-31法尼烯產量均低于菌株WHE4，菌株WHE4-10、WHE4-32和WHE4-33法尼烯的產量均高于WHE4，分別為257.30、286.49、326.64 mg/L。以上結果表明，單獨缺損GPD1、GPD2和LPP1基因、同時缺損CIT2和MLS1基因和同時缺損GAL1、GAL7和GAL10基因對法尼烯的合成無益，同時缺損BTS1和DPP1基因可以弱化FPP的損失，提高法尼烯的產量。

圖7 不同菌株法尼烯合成Fig.7 Farnesene production of engineered strains

2.2.5 5 L發酵罐補料分批發酵

將最佳重組菌WHE4-33在5 L發酵罐水平進行補料分批發酵，結果如圖8所示。在初始20 g/L葡萄糖消耗結束后開始流加葡萄糖溶液(600 g/L)，發酵液中葡萄糖的質量濃度始終控制在1.0 g/L以下，發酵總時長為144 h，最終乙醇和法尼烯的積累分別為70.06、1 578.91 mg/L。

圖8 菌株WHE4-33在5 L發酵罐水平法尼烯的合成Fig.8 WHE4-33 fed-batch fermentation in a 5 L bioreactor

3 結論

近些年，釀酒酵母被廣泛應用于萜類化合物合成的研究，構建一個釀酒酵母萜類化合物高效合成平臺顯得極為重要。本研究以釀酒酵母法尼烯合成菌株為研究對象，通過使用CRISPR-cas9基因編輯技術缺損釀酒酵母關鍵節點基因進行法尼烯合成影響研究。結果發現關鍵節點基因GPD1、GPD2、CIT2、MLS1、GAL1、GAL7、GAL10、BTS1和DPP1的缺損影響法尼烯的合成；從而說明關鍵節點基因涉及的甘油合成途徑、胞質乙酰輔酶A轉運途徑、甲羥戊酸途徑和FPP消耗分支途徑影響法尼烯的合成。然而本研究在補料分批發酵時發現乙醇積累量較高，后續將通過增強乙醇吸收能力提高胞質乙酰輔酶A供給，進一步增強甲羥戊酸途徑的代謝流，從而為代謝工程構建釀酒酵母萜類化合物高效合成平臺提供參考價值。同時可與已有研究有效策略聯合使用，從而構建釀酒酵母萜類化合物高效合成菌株。