黑曲霉pyrG遺傳轉化系統的構建及應用

胡江峰，劉舒雯，楊焱，李林霖，李迎凱，張健*

1(工業發酵微生物教育部重點實驗室，天津科技大學 生物工程學院，天津，300457)2(天津市經濟貿易學校，天津，300381)

黑曲霉具有多種活性強大的酶系[1-2]，對發酵食品的風味和品質起到重要作用，如酸性蛋白酶能催化發酵物料中蛋白質的水解，增加種曲或發酵制品中氨基酸含量，提高營養價值[3]；纖維素酶、葡萄糖氧化酶分解原料能使發酵制品的色、香、味變得更加協調。黑曲霉還是重要的有機酸產生菌，廣泛用于檸檬酸的生產[4]。由于黑曲霉在食品與發酵工業中的重要作用，利用基因工程手段對其進行針對性改造以提高其生產性能越來越受到人們的關注。

通過遺傳代謝手段研究黑曲霉菌株，不僅可以更好地理解其代謝調控機制，還能有目的地進行遺傳改造，提高目標產物的產量，優化菌株的發酵性能[5]。遺傳改造過程中，篩選標記基因必不可少，潮霉素抗性標記hyg[6-7]，博來霉素抗性標記ble[8]是絲狀真菌基因改造時常用的篩選標記，但有些絲狀真菌具有較高的耐藥性，且抗性基因有被轉移到環境和其他微生物的風險，因而其應用有一定局限性[9]。

營養缺陷型標記通過將標記基因轉入相應的營養缺陷型受體菌，實現基因功能互補，使受體菌恢復野生型表型，達到轉化子篩選目的。常用的營養缺陷型有尿苷/尿嘧啶缺陷型[10-11]，亞硝酸鹽缺陷型[12-13]等，其中，尿苷/尿嘧啶營養缺陷型中pyrG基因編碼乳清酸核苷-5′-磷酸脫羧酶，缺乏該酶的菌株無法在不含尿嘧啶核苷的培養基上生長，必須補充尿苷/尿嘧啶才能正常生長，而野生型菌株會把5-氟乳清酸(5-fluoroorotic acid，5-FOA)轉化為致死的5-氟尿嘧啶，因而不能在含5-FOA的培養基生長[14-15]。利用這個特性，一方面可以通過5-FOA篩選獲得尿苷/尿嘧啶營養缺陷型菌株，另一方面可以用不加尿苷/尿嘧啶的培養基篩選回補原養型菌株。

本研究在黑曲霉中成功構建了以pyrG 基因為篩選標記的遺傳轉化系統，獲得1株穩定遺傳的尿苷/尿嘧啶營養缺陷型菌株ng-1，并以pyrG作為回補標記將紅色熒光蛋白rfp成功表達在黑曲霉中[16-17]。

1 材料與方法

1.1 菌株和質粒

黑曲霉CICC 41702(AspergillusnigerCICC 41702)、大腸桿菌DH5α(EscherichiacoliDH5α)、根癌農桿菌AGL1(AgrobacteriumtumefaciensAGL1)、雙元穿梭質粒p44，天津科技大學生化過程與技術實驗室保存；本實驗構建質粒：pyrG敲除質粒pm-1；pyrGYS回補標記質粒pm-2；紅色熒光蛋白rfp表達質粒pm-3。

1.2 試劑

NH4Cl、(NH4)2SO4、K2HPO4、NaCl、葡萄糖、MgSO4·7H2O、瓊脂粉(均為分析純)，天津市北方天醫化學試劑廠；5-FOA、尿苷、尿嘧啶、頭孢噻肟鈉、氨芐青霉素、卡那霉素(均為分析純)，北京市索來寶科技有限公司；DL 5 000 DNA Maker、DL 10 000 DNA Marker、快速DNA聚合酶(5 U/μL)，南京諾唯贊生物科技有限公司；限制性內切酶EcoR I(15 U/μL)、Hind Ⅲ(15 U/μL)、SacⅠ(15 U/μL)、PstⅠ(15 U/μL)，寶日醫生物技術有限公司。

1.3 培養基

大腸桿菌和根癌農桿菌增殖培養采用LB培養基，根癌農桿菌轉化采用IM培養基[18]；黑曲霉所用培養基包括完全培養基(complete medium，CM)[19]、選擇培養基M+met(質量分數)：0.2% NH4Cl，0.1% (NH4)2SO4，0.05% NaCl，0.1% KH2PO4，0.05% MgSO4，0.002% FeSO4，2%葡萄糖，0.15%蛋氨酸。

1.4 儀器與設備

SpX-250B-Z生化培養箱、HHS型電熱恒溫水浴鍋，上海博迅實業有限公司醫療設備廠；LDZX-50FB立式壓力蒸汽滅菌，上海申安醫療器械廠；電子天平，無限量衡器有限公司；光學顯微鏡，OLYMpUS公司；TCL臺式高速離心機，上海醫藥分析儀器廠；全自動凝膠成像儀，北京賽智創業科技有限公司；DYY-6C電泳儀，北京市六一儀器廠；Wp700型格蘭仕微波爐，順德市格蘭仕電器有限公司；正置熒光顯微鏡，北京普析通用儀器有限責任公司。

1.5 引物

研究所使用的引物如表1所示。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study

1.6 質粒的構建

以p44為出發質粒，黑曲霉CICC 41702基因組為模板擴增所需片段。根據NCBI上已經公布的黑曲霉乳清酸核苷-5′-磷酸脫羧酶基因(pyrG)序列(an12 g03570)設計上下游引物，利用pm1-pyrGL-F/R引物對，pm1-pyrGR-F/R引物對分別擴增得到pyrG上、下游同源臂pyrGL(1 200 bp)和pyrGR(1 200 bp)。用引物pm1-pyrGL-F和pm1-pyrGR-R將2個同源臂片段融合成1個片段pyrGLR(2 400 bp)。連接以SacⅠ 和PstⅠ 雙酶切的p44質粒和片段pyrGLR，獲得質粒pm-1。

利用pm2-pyrGYS-F/R引物對擴增pyrGYS片段，該片段包括：pyrG基因上游啟動子區734 bp，pyrG基因1 127 bp，pyrG基因下游終止子區336 bp。以EcoRⅠ和Hind Ⅲ雙酶切p44質粒并與pyrGYS片段連接獲得質粒pm-2。

利用pm3-pyrGYS-F/R，pm3-gpdA-F/R，pm3-rfp-F/R引物對分別擴增得到pyrGYS(2 197 bp)、gpdA啟動子(1 250 bp)和rfp紅色熒光蛋白基因(678 bp)，用pm3-gpdA-F和pm3-rfp-R引物先將gpdA啟動子和rfp紅色熒光蛋白融合為1個片段形成gpdA-rfp(1 928 bp)，再用pm3-pyrGYS-F和pm3-rfp-R引物將pyrGYS與gpdA-rfp融合形成pyrGYS-gpdA-rfp(4 125 bp)。將雙酶切的p44質粒(酶切位點EcoRI，HindⅢ)與pyrGYS-gpdA-rfp連接獲得質粒pm-3，如圖1所示。

圖1 pm-1、pm-2和pm-3質粒的構建Fig.1 The plasmid construction of pm-1, pm-2 and pm-3

1.7 轉化子的篩選

利用同源重組原理，將敲除質粒pm-1通過電轉導入根癌農桿菌AGL1中[20]，菌落PCR驗證成功后，將其與黑曲霉新鮮孢子在含有硝酸纖維膜的IM固體培養基中25 ℃避光共培養60 h，用無菌水將黑曲霉孢子洗至含有尿苷(0.5 g/L)、尿嘧啶(0.5 g/L)、5-FOA(2 g/L)、0.1 g/L的氨芐青霉素和0.25 g/L頭孢噻肟鈉的M+met培養基中，25 ℃培養7～10 d，待其長出轉化子后提基因組進行PCR驗證，將驗證正確的轉化子在CM培養基中遺傳10代驗證其穩定性，獲得尿苷/尿嘧啶營養缺陷型突變株ng-1[21]。將構建的質粒pm-2 和pm-3分別電轉入根癌農桿菌AGL1中后，分別與ng-1的新鮮孢子共培養60 h，以M+met作為選擇培養基，其中添加0.1 g/L的氨芐青霉素和0.25 g/L頭孢噻肟鈉，25 ℃培養7～10 d，待其長出轉化子后提基因組進行PCR驗證，正確的轉化子即為pyrG營養缺陷型菌株的回補菌株和rfp表達菌株。

1.8 轉化子的熒光測定

首先準備干凈的載玻片，用移液槍槍頭吸1滴無菌水滴在載玻片，挑取CM培養基上適量的幼嫩菌絲至載玻片的小水滴中，蓋上蓋玻片，輕輕按壓蓋玻片，擠出蓋玻片內的氣泡和多余的無菌水。放置在正置熒光顯微鏡上的載物臺上，滴1滴香柏油，高倍鏡觀察菌絲形態。在黑暗環境中找到清晰的菌絲后調節光源至綠色光觀察菌絲是否具有紅色熒光[22]。

2 結果與分析

2.1 pyrG敲除菌株的篩選及驗證

如圖2-a所示，尿苷/尿嘧啶營養缺陷型轉化子在含有5-FOA和尿苷、尿嘧啶的M+met培養基中能夠生長，而野生型菌株無法生長。挑取轉化子接發酵小瓶，2 d后待其長出菌絲，提基因組，以引物pm1-pyrGL-F/R驗證轉化子，如圖2-b所示，1、2、4、5、6號泳道條帶大小與預期相符，為正確轉化子，7號泳道為陰性對照；圖2-c中1號泳道為質粒陽性對照，由此可知黑曲霉CICC 41702中的pyrG基因被敲除。挑取正確的轉化子傳10代進行驗證，結果證明pyrG基因敲除性狀能夠穩定的遺傳，選擇1株pyrG基因敲除轉化子命名為黑曲霉ng-1，進行后續pyrG回補試驗。

M-DL 5 000a-pm-1轉化子在復篩板的生長情況；b-pm-1轉化子PCR驗證[1～6-同源重組轉化子黑曲霉；7-黑曲霉CICC 41702陰性對照(3 527 bp)]；c-pm-1質粒陽性對照(2 400 bp)圖2 pm-1轉化子驗證Fig.2 Transformants verification of pm-1

2.2 pyrG營養缺陷型菌株的回補

將pm-2質粒電轉至根癌農桿菌AGL1，侵染黑曲霉菌株ng-1，以不含尿苷/尿嘧啶的M+met作為選擇培養基，共篩選出3株隨機插入轉化子。以pm2-pyrGYS-F/R為引物，進行PCR驗證。如圖3所示，3個轉化子條帶大小與預期相符。將條帶大小正確的轉化子接入添加尿苷、尿嘧啶和5-FOA的培養基中，轉化子不生長；接入只添加尿苷/尿嘧啶的培養基中，轉化子生長，證明從黑曲霉CICC 41702基因組擴增得到的pyrGYS回補標記可用于pyrG型尿苷/尿嘧啶營養缺陷型黑曲霉恢復突變，同時證明黑曲霉ng-1為穩定的pyrG基因缺陷型，可直接用于基因轉化。

M-DL 5 000;1～3-pm-2轉化子驗證全長；4-出發菌株ng-1陰性對照；5-pm-2質粒陽性對照(2 197 bp)圖3 pm-2轉化子驗證Fig.3 Transformants verification of pm-2

2.3 紅色熒光蛋白在黑曲霉中的表達

以黑曲霉ng-1作為出發菌株，以pyrGYS為回補標記，gpdA為紅色熒光蛋白rfp的啟動子pm-3質粒根癌農桿菌轉化，以不含尿苷/尿嘧啶的M+met作為選擇培養基，共篩選出14株隨機插入轉化子。如圖4所示，以引物pm3-pyrGYS-F和pm3-rfp-R對轉化子全長驗證，其中3、5、10、11、13號泳道條帶大小與預期相符，為正確轉化子。將正確的轉化子接入發酵培養基中，待其長出菌絲后，對轉化子菌絲進行熒光顯微鏡檢測，如圖5所示，可知紅色熒光蛋白在ng-1的菌株中很好的表達，證明pyrG基因可作為篩選標記直接進行基因改造，并實現以此為標記的基因操作。

M-DL 10 000a-pm3轉化子全長驗證(1-黑曲霉CICC 41702陰性對照；2～15-轉化子基因組擴增全長)；b-pm-3質粒陽性對照(4 125 bp)圖4 pm-3轉化子驗證Fig.4 Transformants verification of pm-3

a-白光下黑曲霉野生菌絲；b-紅光下黑曲霉野生株菌絲；c-白光下轉化子菌絲；d-紅光下轉化子菌絲圖5 轉化子的熒光觀察Fig.5 Fluorescence observation of transformants

3 結論

本研究利用根癌農桿菌介導的轉化方法，基于同源重組原理，敲除了黑曲霉CICC 41702中pyrG基因，獲得性狀穩定的尿苷/尿嘧啶營養缺陷型黑曲霉ng-1。將包含黑曲霉菌株CICC 41702中pyrG全長基因的質粒pm-2成功轉化到菌株ng-1中，可恢復菌株ng-1的合成尿苷/尿嘧啶的能力，使營養缺陷型菌株恢復野生型菌株的表型，充分證明黑曲霉pyrG基因是一種嚴格的營養缺陷型選擇標記，可用于黑曲霉遺傳轉化系統。利用該系統，成功構建5株熒光蛋白報告菌株，為從細胞水平研究黑曲霉中蛋白的分泌和定位奠定了基礎。