Caulobacter crescentus蔗糖水解酶突變體S271A的重組表達及其轉化蔗糖制備松二糖的研究

邢晨晨，王蕾，郭志勇，張康，陶秀梅，吳敬*

1(江南大學,食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇 無錫，214122)2(江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫，214122)

松二糖(turanose)分子式為C12H22O11，是一分子果糖和一分子葡萄糖以α-1,3糖苷鍵連接而成的還原性二糖，在自然界中基本以D-構型存在，是蔗糖的同分異構體[1]。松二糖存在于蜂蜜中，甜度是蔗糖的一半，其黏度、氣味和甜味持久性都和蔗糖相似[2-3]。與蔗糖相比，松二糖不能被致齲微生物發酵，具有不致齲齒的優勢；同時，松二糖具有低熱量的特點，適合肥胖癥、高血脂、高血壓和糖尿病患者食用[4-5]。因此松二糖在食品工業中廣泛應用于食品添加劑，并有可能取代蔗糖成為一種具有前景的新功能性甜味劑[6]。

用酶轉化法制備松二糖轉化率高，可控性強，并且反應條件較溫和，因此有廣闊的前景。文獻報道制備松二糖的酶主要有2種：環糊精葡萄糖基轉移酶和淀粉蔗糖酶[2, 7-8]。SHIBUYA等[2]將α-環糊精和果糖作為底物，使用嗜熱脂肪芽孢桿菌來源的環糊精葡萄糖基轉移酶制備松二糖的產率為45%。WANG等[8]以2.5 mol/L蔗糖為底物，添加400 U/L多糖奈瑟球菌來源的淀粉蔗糖酶制備松二糖，其產率可達56%。AGARWAL等[9]將淀粉蔗糖酶在大腸桿菌中進行重組表達，經酶轉化后松二糖產率為47%。SU等[7]構建了多糖奈瑟球菌來源的淀粉蔗糖酶突變體(NpAS G396S)，在食品級菌株枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)中成功表達，經酶轉化后松二糖產量為410 g/L，產率為60%，為單一底物制備松二糖的最高水平，但其產物中存在大量的副產物麥芽寡糖。此外，該酶的熱穩定性較差，在30 ℃條件下半衰期僅為48 h，不利于大規模的工業化應用[10]。

實驗室前期構建了Caulobactercrescentus來源蔗糖水解酶的突變體S271A (CcSH S271A)，CcSH S271A是具有淀粉蔗糖酶特征的典型轉苷酶，可利用蔗糖為底物進行分子內轉苷(異構)反應制備松二糖。GUO等[11]研究表明CcSH S271A還具有麥芽寡糖副產物少的特點，可代替淀粉蔗糖酶制備松二糖。本研究將ccshS271A的基因在B.subtilis中成功表達，然后利用該重組酶進行松二糖的制備，并對該酶催化蔗糖制備松二糖的酶轉化工藝進行研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與質粒

菌株B.subtilisWS11[12-13]、B.subtilisSCK6、含有ccsh和ccshS271A基因的重組質粒pET-24a(+)-ccsh和pET-24a(+)-ccshS271A以及質粒pUB110由本實驗室保藏；重組質粒pUB110-ccshS271A和重組菌B.subtilisWS11/pUB110-ccshS271A由本研究構建。

1.1.2 培養基與試劑

LB液體培養基(g/L)：酵母粉 5，蛋白胨 10，NaCl 10。

TB發酵培養基(g/L)：酵母粉 24，蛋白胨 12，KH2PO42.31，K2HPO4·3H2O 16.43，甘油 5。

2×Phanta Max Master Mix，諾唯贊(南京)生物科技技術股份有限公司；聚丙烯酰胺凝膠電泳試劑盒，碧云天生物技術有限公司；質粒抽提試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司；其他試劑均為國產分析純，國藥集團。

1.2 實驗方法

1.2.1 重組菌B.subtilis的構建

依據質粒pUB110和基因ccshS271A的核酸序列，設計以下引物(由5′→3′端，斜體代表同源臂序列)[14]。

P1：aaaaatcaaataaggagtgtcaagaatgattagtaccgcatcta-ttccgacc;

P2：agcttggaggtgtttttttattaccacgagcaactaaccaggtgatac;

P3：tggtatcacctggttagttgctcgtggtaataaaaaaacacctccaa-gctgagt;

P4：accgaagcagaaacagaacgccgccgatccaggagaacaaaa-acgattttttgag;

以質粒pET-24a(+)-ccshS271A為模板，引物P1和P2擴增得到大小為1 827 bp的ccshS271A基因；以質粒pUB110為模板，引物P3和P4擴增得到大小為7 276 bp的線性化質粒。使用POE-PCR的方法將ccshS271A的基因片段和pUB110線性化質粒進行連接[14]。將連接產物轉化B.subtilisSCK6[15-16]，獲得含有ccshS271A基因序列的重組質粒pUB110-ccshS271A。重組質粒進一步轉化B.subtilisWS11，對轉化子提取質粒后由測序公司進行核酸序列檢測，獲得正確的重組質粒和重組菌，并保存甘油菌B.subtilisWS11/pUB110-ccshS271A。

1.2.2 重組菌的搖瓶發酵及重組酶的制備

按2‰的接種量，將保存在甘油管中的菌液接種到LB液體培養基中進行培養。而后將培養8～10 h的種子液按5%的接種量接種到TB發酵培養基中，在溫度為33 ℃的恒溫搖床里，持續發酵24 h。重組酶為胞內酶，收集發酵后的菌體，用50 mmol/L的pH 8.0的K2HPO4-KH2PO4緩沖液復溶后進行高壓勻漿破壁。破壁液體離心后收集上清液，即為重組酶的粗酶液。

1.2.3 蔗糖水解酶活力測定

使用3,5-二硝基水楊酸(3,5-dinitrosalicylic acid，DNS)法對CcSH和CcSH S271A進行酶活力測定[17]。

用50 mmol/L的pH 8.0的K2HPO4-KH2PO4緩沖液配制0.3 mol/L蔗糖溶液作為底物。在具塞試管中加入1.9 mL的底物溶液，放置在水浴鍋中預熱10 min。預熱結束向具塞試管中加入0.1 mL適當稀釋的胞內酶液后混勻，反應10 min后加入3 mL的DNS溶液。而后在100 ℃水中煮沸7 min，并迅速放入冰水中進行冷卻。最后加入10 mL蒸餾水定容到15 mL，在OD540下測定吸光值。一個酶活力單位(U)為在上述條件下催化產生1 μmol/min還原糖當量所需的酶量[8]。

1.2.4 蛋白質的純化方法

采用Ni-Sepharose-HP柱將帶有His-Tag的重組酶粗酶液進行純化。粗酶液上樣結束后用A液進行沖洗，而后分別用體積分數為5%、10%和15% B液進行沖洗，最后用B液洗脫后收集所有的洗脫液，即為純化的重組酶。

結合緩沖液(A液)成分(mmol/L)：Tris-HCl 25，NaCl 500，調節pH至7.0。

洗脫緩沖液(B液)成分(mmol/L)：咪唑 300，Tris-HCl 25， NaCl 500，調節pH至7.0。

1.2.5 酶學性質分析

溫度對酶活力的影響：將酶在30、35、40、45、50、55 ℃條件下按照1.2.3所示方法進行酶活力測定。

溫度穩定性的考察和半衰期的測定：將酶分別置于30、35、40、45 ℃的水浴鍋中，30、35 ℃每隔24 h取樣，40、45 ℃每隔8 h取樣，測定樣品的酶活力，考察酶的溫度穩定性并測定半衰期。半衰期為酶活力下降為最初活力一半時所需的時間。

pH對酶活力的影響：用不同pH(5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0)的50 mmol/L K2HPO4-KH2PO4緩沖液和不同pH(9.0、10.0、11.0)的50 mmol/L Na2CO3-NaHCO3緩沖液配制底物，并用上述不同pH的緩沖液將酶液稀釋至合適的倍數，在30 ℃的條件下測定酶活力。

pH穩定性的考察：將上述用不同pH緩沖液稀釋的酶液在30 ℃水浴鍋中放置48 h后測定酶活力。

相對酶活力：定義最高酶活力為100%，其他條件下測得的酶活力與最高酶活力的相對值即為相對酶活力。

1.2.6 松二糖的酶轉化工藝優化

以不同濃度的蔗糖(1.0、1.5、2.0、2.5 mol/L)為底物，用不同pH (5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0)的緩沖液溶解底物，CcSH S271A分別以不同添加量(30、60、90、120、150 U/g蔗糖)添加至底物中，置于轉速為150 r/min、不同溫度(20、25、30、35、40、45、50 ℃)的水浴搖床中反應48 h。每次酶轉化工藝控制單一變量，逐步優化。

1.2.7 HPLC檢測產物

將酶轉化反應產物離心取上清液，用水稀釋至適當倍數后與乙腈等比例進行混合，并用0.22 μm的濾頭進行過濾。使用Agilent 1200 HPLC色譜儀的示差折光檢測器(refractive index detector，RID)進行檢測，色譜柱為(4.6 mm×250 mm，5 μm) Syncronis Amino Column，柱溫為35 ℃，流動相是體積分數為80%的乙腈和水的混合液，流速為0.8 mL/min，松二糖產率的計算如公式(1)所示：

(1)

2 結果與分析

2.1 蔗糖水解酶突變體在枯草芽孢桿菌中的構建與表達

將1.2.1所示方法構建成功的重組菌B.subtilisWS11/pUB110-ccshS271A按照1.2.2所示的方法獲得重組酶CcSH S271A，并進行SDS-PAGE分析。如圖1所示，泳道1在66.2 kDa附近有一條清晰的蛋白條帶，與CcSH S271A理論相對分子質量(65.7 kDa)相符，且測得胞內上清液的酶活力為3.0 U/mL，說明CcSH S271A在B.subtilisWS11中表達成功。

M-中分子質量蛋白marker;1-重組菌胞內上清液圖1 重組蛋白CcSH S271A的SDS-PAGE分析Fig.1 SDS-PAGE analysis of recombinant protein CcSH S271A

2.2 C.crescentus蔗糖水解酶及突變體的純化及酶學性質分析

2.2.1C.crescentus蔗糖水解酶及突變體的純化

對蔗糖水解酶野生型CcSH和突變體CcSH S271A進行純化，SDS-PAGE結果如圖2所示，在泳道1和2的66.4 kDa附近有單一的蛋白條帶，與CcSH和CcSH S271A理論相對分子質量相符，表明該酶達到電泳純。使用DNS法分別測定純化前后的野生型和突變體的酶活力，并用BRADFORD法[18]測定蛋白質濃度，計算得出CcSH和CcSH S271A純化后的比活力分別為12.5、13.1 U/mg，說明單點突變S271A并未影響該酶的比活力。

M-低分子質量蛋白marker;1-純化CcSH;2-純化CcSH S271A圖2 純化CcSH和CcSH S271A的SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of purified CcSH and CcSH S271A

2.2.2 溫度對C.crescentus蔗糖水解酶及突變體的影響

酶的三維結構和分子熱運動會受溫度的影響，從而對酶結合和利用底物的能力產生影響，因此，酶促反應的催化速率會受到溫度的影響[19-21]。如圖3所示，野生型和突變體的酶活力隨著溫度升高呈現先升后降的趨勢，最適溫度均為45 ℃，當溫度超過50 ℃時酶活力驟降，說明酶促反應時的溫度不宜過高。

圖3 溫度對CcSH和CcSH S271A反應活性的影響Fig.3 Effect of temperature on the activity of CcSH and CcSH S271A

為了探究重組酶的熱穩定性，分別測定該酶在30、35、40、45 ℃的半衰期。如圖4所示，在30、35、40、45 ℃時，野生型CcSH和突變體CcSH S271A半衰期分別為312、120、48、40 h。結果說明，30 ℃時野生型和突變體熱穩定性最好。

a-30 ℃溫度穩定性；b-35 ℃溫度穩定性；c-40 ℃溫度穩定性；d-45 ℃溫度穩定性圖4 CcSH和CcSH S271A的溫度穩定性Fig.4 Thermostability of CcSH and CcSH S271A

2.2.3 pH對C.crescentus蔗糖水解酶及突變體的影響

酶促反應的pH會影響酶的解離狀態，影響酶促反應的催化速率[22]。如圖5-a所示，CcSH和CcSH S271A的最適pH均為8.0，在偏酸和偏堿的條件下酶的催化活力均下降，pH在6.5～8.5時，相對酶活力均在85%以上，超過該pH范圍時，酶活力驟降。

a-CcSH和CcSH S271A的反應活性；b-CcSH和CcSH S271A的穩定性圖5 pH對CcSH和CcSH S271A反應活性和穩定性的影響Fig.5 Effect of pH on the activity and stability of CcSH and CcSH S271A

由圖4可知，CcSH和CcSH S271A在30 ℃時熱穩定性最好，因此將上述不同pH的酶液在30 ℃水浴鍋中放置48 h后進行酶活力的測定，考察酶的pH穩定性。如圖5-b所示，CcSH和CcSH S271A在偏堿或偏酸的條件下放置48 h后酶活力均下降明顯，pH在6.0～8.0酶活力較穩定，相對酶活力均在80%以上，且在pH 8.0時該酶最穩定。

2.3 C.crescentus蔗糖水解酶突變體制備松二糖的工藝優化

以蔗糖為底物，突變體CcSH S271A合成的產物中松二糖占比最高，在初始酶轉化工藝條件下產率可達56.3%，而野生型在同等條件下松二糖產率僅為22.8%。因此選擇突變體CcSH S271A進行松二糖的制備，并從加酶量、初始pH、反應溫度和蔗糖濃度4個方面對制備松二糖的工藝進行優化。

加酶量對合成松二糖的影響：結果如圖6-a所示，松二糖的產量隨著加酶量的增加呈現先升后降的趨勢，當加酶量為60 U/g蔗糖時，達到松二糖最高產率58.2%。過量添加酶會對松二糖的生成有負面影響，造成該現象的原因可能是CcSH S271A存在副反應水解反應[11]，在產物松二糖達到一定產量后，生成松二糖的轉苷(異構)反應接近平衡狀態，此時加酶量的增加不會進一步增加松二糖的產量。但是，副反應水解反應隨加酶量的增加而增加，其水解底物蔗糖的能力加強，使得用于參與異構反應的底物量減少，導致松二糖的產量降低。

反應溫度對合成松二糖的影響：在上述最優加酶量的基礎上，對酶轉化的溫度進行優化。結果如圖6-b 所示，在溫度為30 ℃時，達到松二糖的最高產率58.4%，隨著溫度的升高，松二糖的產率降低。此時的酶轉化最適溫度與酶促反應的最適溫度不一致，分析推測原因主要有3點：第一，制備松二糖時利用的是CcSH S271A酶的轉苷活性，而利用DNS法檢測的是轉苷活性和水解活性的總活性，轉苷活性的最適溫度與該酶的轉苷和水解總活性的最適溫度不一致；第二，測定的酶活力考察的是短時間的酶催化性能，而酶轉化制備松二糖考察的是一段較長的時間內酶的綜合性能，這段時間內底物已經部分轉化為產物，因此存在反應的平衡問題；第三，如圖4所示，CcSH S271A在30 ℃時比在45 ℃時更穩定，低溫下酶活力保持更久，使得松二糖產率較高。

初始pH對合成松二糖的影響：酶蛋白在一定的pH范圍內酶活力相對穩定，而pH過酸或者過堿時會導致酶蛋白的催化中心相同電荷的基團互相排斥，從而解離，這會使得酶蛋白變性失活。在上述最適加酶量和最適溫度的基礎上，對初始pH進行優化。結果如圖6-c所示，當pH為8.0時，達到松二糖的最高產率66.3%，隨著pH的升高，松二糖的產率迅速降低。

蔗糖濃度對合成松二糖的影響：在上述酶轉化工藝條件優化的基礎上，對底物蔗糖濃度進行優化。結果如圖6-d所示，當蔗糖濃度為2.0 mol/L時，松二糖的產量為453.5 g/L，產率可達66.3%，比SU等[7]報道的在相同的酶轉化條件下的松二糖產量提高了43.5 g/L。

a-催化制備松二糖的CcSH S271A加酶量優化；b-催化制備松二糖的溫度優化；c-催化制備松二糖的初始pH優化；d-催化制備松二糖的初始蔗糖濃度優化圖6 C.crescentus蔗糖水解酶突變體制備松二糖的工藝優化Fig.6 Process optimization of the C.crescentus sucrose hydrolase mutant for the preparation of turanose

3 結論

本研究將C.crescentus來源蔗糖水解酶突變體ccshS271A的基因與表達載體pUB110連接轉入食品安全級菌株B.subtilisWS11，獲得重組菌B.subtilisWS11/pUB110-ccshS271A。對CcSH S271A的酶學性質進行研究，該酶在45 ℃、pH 8.0的條件下酶活力最高，且在30 ℃條件下熱穩定性最好，半衰期為312 h，比常用作制備松二糖的淀粉蔗糖酶高264 h[10]。而后對CcSH S271A制備松二糖的酶轉化工藝進行系統優化，最終獲得最優反應體系，在pH 8.0，30 ℃的條件下，以2.0 mol/L蔗糖為底物，添加60 U/g蔗糖的CcSH S271A制備松二糖，產率為66.3%，為目前報道的最高松二糖產率[7]，為工業上大體系進行酶轉化制備松二糖提供了理論依據。