動物雙歧桿菌乳亞種M8胞外多糖的分離純化和分子特征

顏準，吳朝君，張小蘭，李婉麒，梁娟，陳紫穎，艾連中，張匯

(上海理工大學 醫療器械與食品學院，上海食品微生物工程技術研究中心，上海，200093)

胞外多糖(exopolysaccharide，EPS)是益生菌在發酵過程中分泌產生的黏液物質，是益生菌發酵液中的重要活性成分，具有調節腸道菌群結構、抗腫瘤、抗氧化、調節免疫、降膽固醇等生物功能[1-4]，此外，EPS還作為天然來源的增稠劑和乳化穩定劑，在乳制品和其他食品中得到越來越廣泛的應用[5-7]。雙歧桿菌是從嬰兒糞便中分離得到的一種專性厭氧、無運動性、無芽孢、無鞭毛及莢膜的革蘭氏陽性菌，具有多種益生功能，如抑制腫瘤、抑制病原菌生長、改善腸炎和便秘等，是健康人體腸道微生物菌群的重要組成菌屬之一[8]。雙歧桿菌發揮益生作用的機制與自身分泌的EPS有著密切關系，研究表明，EPS可通過增強宿主免疫和抗病原菌功能來促進雙歧桿菌與宿主的共生相互關系[9]。

目前，關于雙歧桿菌EPS的研究比較有限，主要集中于EPS的生物合成機制、化學組成以及生物活性功能等[10]。ROBERTS等[11]首次報道了一種產酸性EPS的長雙歧桿菌BB-79，并證明乳糖作為主要碳源時，EPS產量最高。其后，多種雙歧桿菌EPS被報道，現有研究表明，雙歧桿菌EPS可分為中性多糖和酸性多糖兩大類，其單糖主要由半乳糖、葡萄糖和甘露糖組成，具有良好的抗炎、抗氧化、腸道益生等生物功能[4, 12-13]，以及增黏、乳化等物理功能[5]。然而，目前在分離純化雙歧桿菌EPS方面，均采用陰離子交換色譜(anion-exchange chromatography, AEC)和凝膠過濾色譜相結合的方式，使得分離純化效率低、成本高，不適合于大規模的制備生產。建立一種穩定、高效、經濟的EPS分離純化模型，將為雙歧桿菌EPS的深入研究和應用開發奠定理論基礎。

益生菌產EPS通常都是含有多個級分的雜多糖，部分EPS還可能結合蛋白質或肽類形成糖-蛋白或糖-肽復合物[14]，根據EPS的化學組成和分子質量分布，需要選擇不同的方法對其進行分離純化，如有機試劑沉淀法、離子交換色譜、凝膠過濾色譜、膜分離法或不同方法組合等[15]，其中，有機試劑沉淀法和離子交換色譜被認為是具有高效、可規?；苽涮卣鞯姆椒ǎz過濾色譜成本高、效率低、穩定性差，膜分離法雖可實現大規模制備，但存在成本高、膜孔易堵等問題。因此，本研究以1株分離自內蒙古呼和浩特市健康婦女母乳中的高產EPS菌株——動物雙歧桿菌乳亞種M8作為研究對象，通過厭氧發酵生產EPS，分別采用乙醇分級沉淀(ethanol gradient precipitation, EGP)和AEC對EPS進行分級處理，以期建立一種高效的分離純化工藝，為進一步深入研究M8產EPS的結構與功能及其相互關系奠定科學依據。

1 材料與方法

1.1 菌種與培養基

本研究中所使用的動物雙歧桿菌乳亞種M8由內蒙古農業大學篩選、鑒定并保藏。

BS培養基(g/100mL)：胰蛋白胨1.0，葡萄糖0.5，牛肉膏0.5，檸檬酸鉍銨0.2，磷酸氫二鈉0.4，煌綠0.002 5，FeSO4·7H2O 0.03，瓊脂1.8。

1.2 主要試劑

無水乙醇、三氯乙酸、苯酚、咔唑，上海泰坦科技股份有限公司；葡萄糖、半乳糖醛酸、牛血清蛋白、考馬斯亮藍，上海源葉生物科技有限公司；NaCl、NaNO3、NaOH、乙酸鈉、磷酸、硫酸，國藥集團化學試劑有限公司。

1.3 儀器與設備

Avanti JXN-26高速冷凍離心機，美國貝克曼庫爾特有限公司；N-1100旋轉蒸發儀，上海愛郎儀器有限公司；SP-752紫外可見分光光度計，上海光譜儀器有限公司；多角度激光光散射儀，美國懷亞特技術有限公司；ICS-5000離子色譜儀，戴安科技有限公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 動物雙歧桿菌乳亞種M8的發酵與EPS的提取

配制BS培養基2 L，用高溫高壓滅菌鍋于115 ℃滅菌15 min，將活化后的種子液按2%接種量接入BS液體培養基中，于37 ℃下無氧發酵40 h。發酵結束后，100 ℃煮沸發酵液，并保持10 min，對發酵液進行殺菌。冷卻后發酵液在4 800 r/min離心20 min，取上清液，加入10%(體積分數)的三氯乙酸溶液，攪拌均勻后靜置12 h，離心，上清液用堿液中和后，緩慢加入3倍體積的無水乙醇，攪拌均勻，靜置過夜，離心得到醇沉產物。醇沉物復溶于去離子水，用截留分子質量8 000 Da的透析袋對水透析48 h以上，透析袋濃縮后，真空冷凍干燥得到粗EPS。

1.4.2 總糖、蛋白質和糖醛酸含量測定

以葡萄糖為標準，通過苯酚-硫酸法[16]對多糖樣品的總糖含量進行測定；以牛血清蛋白(bovine serum albumin，BSA)為標準，通過考馬斯亮藍法[17]測定樣品中的蛋白質含量；以半乳糖醛酸標準，通過硫酸-咔唑法[18]對樣品中的糖醛酸含量進行測定。所有實驗重復3次，取平均值。

1.4.3 EGP分離純化

根據ZHANG等[19]的方法對粗EPS進行分級純化。稱取粗EPS 200 mg，加入20 mL去離子水中，水浴加熱，充分攪拌溶解后配制成10 mg/mL的溶液。配制的溶液經4 800 r/min離心20 min，上清液轉至透明燒杯中。緩慢均勻地向上清液中加入無水乙醇，使溶液變渾濁后停止加入(經計算，此時渾濁液中乙醇的體積分數為35%)，置于4 ℃冰箱中靜置2 h，離心，將沉淀和上清液分離。沉淀中加入無水乙醇洗滌3次，干燥，得到級分F35%。在上清液中繼續加入無水乙醇，使溶液體積分數分別達到45%、55%、75%，重復上述步驟，分別得到級分F45%、F55%、F75%。

1.4.4 AEC分離純化

采用AEC法對粗EPS進行分級純化[20]。將DEAE-Sepharose Fast Flow填料進行預處理，濕法裝柱，用5倍柱體積的超純水平衡。將配制的10 mg/mL多糖溶液過濾(0.45 μm濾膜過濾)，上樣10 mL，依次采用4倍柱體積的超純水、0.1、0.2、0.5 mol/L NaCl溶液(pH均為6.8)進行梯度洗脫，收集不同梯度的洗脫液。將洗脫液在55 ℃下減壓濃縮，透析除鹽，真空冷凍干燥，得到純水洗脫級分Fw，以及0.1、0.2、0.5 mol/L NaCl溶液洗脫級分F0.1、F0.2和F0.5。

1.4.5 單糖組成分析

采用高效陰離子交換色譜串聯脈沖安培檢測器(high performance anion exchange chromatography-pulsed electrochemical detection，HPAEC-PAD)分析粗分離純化前后EPS的單糖組成[21]。稱取5 mg樣品于具塞試管中，冰浴下加入0.5 mL 12 mol/L硫酸，室溫下攪拌反應30 min。向試管中加水將硫酸稀釋分離純化后至2 mol/L，100 ℃水解2 h，冷卻至室溫，將水解液用超純水稀釋50～100倍，稀釋液用0.22 μm針孔過濾器過濾，進樣分析。采用Dionex ICS-5000離子交換色譜系統，配有脈沖安培檢測器，CarboPacTM PA20保護柱和 CarboPacTM PA20分析柱(4 mm×250 mm)。色譜峰與標準品(巖藻糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖、核糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸)比對，進行定性和定量分析。

1.4.6 多糖樣品純度及分子質量測定

采用高效分子排阻色譜(high performance size exclusion chromatography，HPSEC)測定分離純化前后EPS的分子質量及其分布[22]。HPSEC串聯了多角度激光光散射檢測器(multi-angle laser light scattering detector，MALLS)、示差檢測器(differential refractive index detector，dRI)、黏度檢測器以及紫外檢測器(ultraviolet detector，UV)，色譜柱為OHpak SB-805 HQ和OHpak SB-803 HQ分析柱(8.0 mm×300 mm)串聯，流動相為0.1 mol/L NaNO3，流速0.6 mL/min，進樣量100 μL，進樣質量濃度為1 mg/mL，檢測時間80 min，柱溫40 ℃。數據分析采用ASTRA 7.1.3軟件進行處理，通過zimm plot擬合，得到樣品分子質量Mw、回旋半徑Rg、特性黏度[η]及相關溶液構象信息。

1.4.7 數據分析

所有實驗平行測量3次，數據采用均值±標準差表示。采用SPSS statistics 17.0軟件進行單因素方差分析及多重比較分析，P<0.05為差異顯著，有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 粗EPS化學成分及分子排阻色譜行為分析

天然來源的多糖一般都具有成分不均一、分子質量分布寬等問題，而化學成分和分子質量的不均一性又大大地限制了多糖的基礎研究和應用[23]。因此，對于天然來源的多糖提取物，一般都需要進行分離純化。根據不同多糖的組成和性質，分離純化的方法有所不同，常用的方法有EGP法、離子交換色譜、凝膠排阻色譜和膜分離法等[15]，其中EGP法和離子交換色譜是多糖分離純化最常用，也是最容易實現大規模制備的方法。然而，這些方法的應用與多糖的化學組成和分子質量分布有密切關系。對于分子質量分布和級分間溶解性差異顯著的多糖樣品，可選擇EGP法[23]；對于分子中帶電荷數量差異顯著的多糖樣品，可通過離子交換色譜來進行分級，如中性多糖與酸性多糖的分離[20]；而對于分子質量分布差異不明顯，性質比較接近的樣品，則需要借用分子排阻色譜等方法來進行細分[24]。因此，在選擇分離純化方法之前，確定待純化樣品的化學組成和分子質量分布非常重要。

本研究采用苯酚-硫酸法、考馬斯亮藍法和硫酸-咔唑法分別測定了M8產粗EPS的中性糖、蛋白質和糖醛酸含量，結果表明,粗EPS中中性糖含量為63.4%，蛋白質含量為5.9%，糖醛酸含量為6.7%(表1)。進一步采用HPAEC-PAD測定了粗EPS的單糖組成，結果表明粗EPS主要由半乳糖、葡萄糖、甘露糖和葡萄糖醛酸組成(表1)。由此推測，粗EPS是由中性多糖和一定量的酸性多糖級分組成，并綴合一定量的蛋白。

表1 動物雙歧桿菌乳亞種M8產胞外多糖乙醇分級沉淀前后化學組成分析比較Table 1 Comparison between the chemical compositions of exopolysaccharides produced by Bifidobacterium Animalis subsp lactis M8 and its fractions fractionated by gradient ethanol precipitation

為了分析粗EPS的分子質量分布，對其進行了HPSEC行為研究，結果如圖1所示。通過洗脫曲線(RI檢測器)可知，粗EPS主要有2個色譜峰(27、31 min處)，此外，在22 min處也出現1個小峰，表明粗EPS中含有至少3個不同分子質量分布的級分。

圖1 動物雙歧桿菌乳亞種M8產胞外多糖的高效凝膠排阻色譜圖Fig.1 High performance gel exclusion chromatographic curve of crude polysaccharides produced by Bifidobacterium Animalis subsp. lactis M8

以上結果表明，M8產胞外多糖是一種分子質量分布不均一，含有不同化學組成的多糖混合物，需要進一步的分離純化，以為M8產胞外多糖的結構鑒定和功能解析奠定科學依據。針對M8產粗EPS的分子排阻色譜行為分析，該多糖分子質量分布較寬，滿足EGP所需的基本條件。此外，化學成分分析表明該EPS中含有一定量的葡萄糖醛酸和蛋白質，可能存在帶有不同電荷的級分，可通過AEC來進行分離純化。因此，本研究分別采用EGP法和AEC法對粗EPS進行分離純化，并通過化學成分分析和分子排阻色譜來評價分離純化的效果。

2.2 EGP法

采用EGP的方法，對M8產EPS進行分級純化，依次在乙醇終體積分數為35%、45%、55%和75%，分離沉淀出4個多糖級分，分別記為F35%、F45%、F55%和F75%，經醇洗、冷凍干燥后，4個多糖級分的得率依次為2.14%、7.79%、21.01%和10.64%，總回收率為41.58%(表1)。由此可知，EGP法所得主要級分為F55%，總回收率(41.58%)偏低，這可能與不同級分在乙醇溶液中的相分離效果和沉淀程度有關。EGP本質是在乙醇的作用下，多糖溶液發生不同程度的相分離，低溶解性的多糖級分會先沉淀分離出來，而高溶解性的多糖級分需要在高乙醇濃度下才能沉淀分離。通常來說，多糖在水中的溶解性與其分子質量大小呈反比，分子質量越大，溶解性越低，因此，認為在低乙醇濃度下相分離得到的多糖級分，其分子質量更大，而高乙醇濃度下分離得到的級分，分子質量更小。然而，多糖的化學組成、糖苷鍵連接方式、主鏈構成和支鏈分布等同樣會影響多糖的溶解性，因此，EGP法也不僅僅與分子質量有關，還與多糖的化學結構和分子構象有密切關系[23]。

為了評價EGP法的分級效果，分別對F35%、F45%、F55%和F75%4個級分進行了化學組成分析，結果如表1所示。結果顯示，級分F35%中性糖含量為28.68%，糖醛酸含量較低(2.11%)，蛋白含量相對較高(15.57%)，表明該級分可能是富集的蛋白多糖類大顆粒物質，而該級分所測成分的總含量整體偏低，這可能是由于復雜的成分組成干擾了不同成分的顯色效果，從而導致比色結果偏低；隨著乙醇濃度的提高，級分F45%、F55%、F75%的中性糖含量逐漸升高，糖醛酸成分主要富集在F45%和F55%2個級分，蛋白質含量逐漸降低，表明隨著乙醇濃度的提高，多糖純度提高。單糖組成分析表明，級分F35%主要由葡萄糖組成，含有少量的半乳糖和甘露糖；F45%、F55%和F75%3個級分中，半乳糖含量逐漸增加，葡萄糖含量降低，其中葡萄糖醛酸主要分布在F45%和F55%2個級分中。從單糖組成結果可知，乙醇分級沉淀得到的4個級分將酸性多糖富集在F45%和F55%級分中，同時，該2個級分的單糖組成沒有顯著性差異，可認為屬于同一類雜多糖。

進一步，采用HPSEC對4個級分的分子質量分布進行了分析，結果如圖2所示。級分F35%(黑色線)呈現對稱的單峰，表明其均一性良好，而F45%、F55%和F75%3個級分均出現肩峰或雙峰，表明其不是單一的級分。結合化學成分分析結果，F35%雖然具有良好的均一性，但糖純度(總糖含量)較低，被認為是非多糖級分，F45%、F55%和F75%的糖純度雖然提高了，但為非均一組分，因此，認為EGP法無法對M8產胞外多糖進行有效的分離純化。

圖2 動物雙歧桿菌乳亞種M8產胞外多糖乙醇分級沉淀后不同級分的高效凝膠排阻色譜曲線Fig.2 High performance gel exclusion chromatographic curves of fractions fractionated by gradient ethanol precipitation from crude polysaccharides produced by Bifidobacterium Animalis subsp. lactis M8

2.3 AEC法

帶電荷的多糖分子可與陰離子交換樹脂結合，通過純水和不同離子強度的洗脫液可將中性級分和帶不同電荷的級分分離開，從而用于分離帶不同電荷的多糖級分，如中性、酸性多糖、蛋白聚糖等[15]。本研究借助DEAE-Sepharose Fast Flow色譜填料，依次采用純水、0.1、0.2、0.5 mol/L NaCl溶液作為洗脫液，從粗EPS中分離得到了4個級分，分別記為Fw、F0.1、F0.2和F0.5，各級分的得率如表2所示，Fw是一種中性多糖，不含糖醛酸，也未檢測出蛋白質，但其得率最低，表明粗EPS中中性多糖級分含量較少；F0.1和F0.2的得率分別為15.06%和 29.62%，中性糖含量較高，且含有一定量的糖醛酸，其中，F0.2的糖醛酸含量達到8.40%，表明糖醛酸主要富集在F0.2級分中；F0.5級分得率最高，中性糖含量為67.28%，糖醛酸含量較低，主要富集了粗多糖中的蛋白組分，推測可能為一種蛋白聚糖，由于蛋白組分中含有較多的負電荷，可被陰離子交換樹脂吸附。從表2可知，通過AEC分離，可對粗EPS進行有效的分級，得到糖純度較高的中性多糖(Fw)和不同糖醛酸含量的酸性多糖(F0.1和F0.2)，以及富集了蛋白的糖級分F0.5，4個級分總回收率為99.35%，明顯高于EGP法。

表2 動物雙歧桿菌乳亞種M8產胞外多糖乙醇分級沉淀前后化學組成分析比較Table 2 Chemical compositions of exopolysaccharides produced by Bifidobacterium Animalis subsp. lactis M8 and its fractions fractionated by anion exchange chromatography

單糖組成結果表明,Fw可被認為是一種葡聚糖，含有少量的半乳糖和甘露糖；F0.1、F0.2和F0.5均為以葡萄糖為主的酸性雜多糖，其中F0.2相對于其他級分，半乳糖和葡萄糖醛酸比例最高。以上結果與化學成分分析結果一致，表明AEC法可對粗EPS的不同級分進行有效分離。

進一步的，對AEC法分級得到的4個級分進行分子質量分布分析，結果如圖3所示。級分Fw和F0.1均不是均一的級分，然而，F0.2和F0.52個級分均呈現單一對稱的色譜峰，表明這2個級分均有良好的均一性。此外，通過多檢測器在線同時檢測，發現級分F0.5的dRI信號與UV(280 nm)檢測信號出峰一致，這表明F0.5中的糖組分與蛋白組分是結合態，可認為是一種蛋白聚糖[24]。結合化學成分分析結果，得率較低的Fw和F0.1級分，雖然糖純度(總糖含量)較高，但分子質量分布不均一，而F0.2和F0.52個級分的糖純度和均一性均達到分離純化的要求，其中F0.2為一種酸性雜多糖，而F0.5為一種蛋白聚糖，該2級分的總回收率達80.85%，表明AEC法能夠有效將分布不均一的中性級分除去，并將分布均一的酸性級分和蛋白聚糖級分得到有效的分離。

2.4 純化級分的分子參數分析

采用HPSEC-MALLS對均一級分F0.2和F0.5的分子質量及其溶液性質進行分析，結果如表3所示，F0.2級分的重均分子質量(Mw)為21.4 kDa，多分散系數為1.51，具有良好的均一性，Rg為27.2 nm，特性黏度[η]為0.32 dL/g；而F0.5的Mw比F0.2略大，但其Rg卻更小、[η]更大，表明F0.5分子結構更緊湊。

圖3 動物雙歧桿菌乳亞種M8產胞外多糖陰離子交換色譜分級后不同級分的高效凝膠排阻色譜曲線Fig.3 High performance gel exclusion chromatographic curves of fractions fractionated by anion exchange chromatography from crude polysaccharides produced by Bifidobacterium Animalis subsp.lactis M8

表3 陰離子交換色譜分離純化級分F0.2和F0.5分子參數分析Table 3 Molecular parameters of fractions of F0.2 and F0.5 fractionated by anion exchange chromatography

3 結論

本研究比較分析了EGP法和AEC法分離純化動物雙歧桿菌乳亞種M8產EPS的效果，確定了M8產EPS的分離純化工藝為：陰離子交換色譜分級，柱填料為DEAE-Sepharose Fast Flow，梯度洗脫溶劑依次為純水、0.1、0.2、0.5 mol/L NaCl溶液，由此制備得到糖純度和均一性均良好的多糖級分F0.2和F0.5。分子結構特征分析表明，F0.2為一種酸性雜多糖，主要由葡萄糖、半乳糖、甘露糖和葡萄糖醛酸組成，在水溶液中呈剛性較強的松散線團結構；而F0.5則為一種蛋白聚糖，糖鏈組成與F0.2相似，但糖醛酸含量更低，并綴合了蛋白組分，使得F0.5在水溶液中呈緊湊的柔性卷曲狀結構。本研究確定的分離純化方法具有高效、經濟、回收率高等特點，可實現大規模制備，同時，本研究也為動物雙歧桿菌乳亞種M8產EPS的結構與功能及其相互關系研究和M8在食品工業中的應用奠定科學依據。