宰后不同部位牛肉保水性變化和蛋白質特性研究

左惠心，溫彬，羅欣，朱立賢，牛樂寶，張一敏，毛衍偉

(山東農業大學 食品科學與工程學院，山東 泰安，271018)

保水性(water-holding capacity，WHC)是指肌肉保持其原有水分與添加水分的能力[1]，牛肉保水性的大小與嫩度、風味、多汁性和營養價值等食用品質密切相關[2]。在屠宰、加工、貯藏和運輸過程中，牛肉中的汁液會不可避免地發生損失，流失的汁液在很大程度上影響了肉品品質、造成經濟損失[3-4]。對于生鮮肉和肉品加工行業來說，保水性是當今最重要的肉品品質之一[5]。研究表明，不同部位牛肉的保水性存在差異[6]，但不同部位牛肉保水性存在差異的原因尚不明確。近年來，小包裝分割冷鮮肉銷量逐年上升，人們更加關注畜禽肉不同部位之間食用品質的差異[7]。因此，研究不同部位肌肉保水性的變化規律及其差異因素，不僅具有重要的理論價值，而且具有重要的經濟意義。

研究表明，肉品保水性受蛋白質空間結構的變化、肌球蛋白和肌動蛋白絲間凈電荷作用的影響[8-9]。SCHFER等[10]指出，細胞骨架蛋白在肉品成熟過程中結構變化會引起細胞形態以及肉品保水性的改變。LAWSON等[11]研究表明連接細胞骨架和胞外基質的整合素蛋白對豬肉中汁液流失通道的形成至關重要。ZHANG等[12]也有類似的研究結果，其研究發現肌間線蛋白的完整性、整合素蛋白的降解、μ-鈣蛋白酶含量與宰后豬肉的保水性變化有關。這些研究說明肌纖維結構變化、水分溢出、汁液流失通道等與汁液損失有重要聯系，可以解釋大部分汁液流失現象。然而，這些研究并不能對肉的保水性提供完整的解釋，也無法直接證明是否是蛋白質的降解導致肉中水分的流失。LI等[13]運用差示掃描量熱儀(differential scanning calorimetry，DSC)研究了冷卻豬肉在成熟過程中保水性變化與蛋白質變化的關系，結果表明，在成熟過程中蛋白質發生降解，且與肌漿蛋白變性程度呈顯著負相關關系(R=-0.91,P<0.05)。MA等[14]對成熟過程中不同部位肌肉的蛋白水解變化與肉品品質特性進行了相關性分析，結果表明，在成熟過程中，不同部位肌肉的蛋白質水解變化是以其特有的方式發生的，這可能導致成熟過程中不同肌肉的肉質變化速率和程度不同。

本研究以冷卻牛背最長肌、半膜肌和腰大肌作為研究對象，在各成熟時間點采集樣本，測定蛋白質化學作用力的變化；并運用DSC測定肌肉蛋白質的變性程度。通過研究蛋白質化學作用力變化和蛋白質熱變性規律變化，從蛋白質特性變化的角度分析不同部位牛肉保水性存在差異的原因，以期為全面闡明宰后不同部位牛肉保水性機制提供新視角，為分割牛肉市場價值和加工特性的提高提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本實驗所用牛肉樣品采自山東省陽信縣某公司，挑選8頭體重相近，18～24月齡左右的雜交公牛(魯西黃牛×西門塔爾牛)，按照伊斯蘭屠宰方式屠宰，胴體在排酸庫冷卻成熟24 h后，取左半胴體的背最長肌(第12根胸肋到腰椎末尾)、半膜肌、腰大肌部位，將肉樣于4 ℃環境溫度下運回實驗室，對肉樣分割成2.54 cm厚度的牛排并進行托盤包裝，進行后續試驗。

氯化鈉(分析純)，天津市凱通化學試劑有限公司；無水乙醇、磷酸鹽緩沖液，國藥集團化學試劑有限公司；尿素、Lowry法蛋白定量試劑盒，北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設備

AB104-S分析天平，瑞士Mettler Toledo公司；BD-145HDE冷藏冷凍轉換柜，青島海爾特種電冰柜有限公司；5804R高速冷凍離心機，德國Eppendorf公司；IKA T18勻漿機，艾卡儀器設備有限公司；YYW-2應變控制式無側限壓力儀，南京土壤儀器廠有限公司；SpectraMax M5酶標儀，美國Molecular Devices公司；DSC-200PC差示掃描量熱儀，德國NETZSCH公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 失水率的測定

參照FRANCO等[15]的方法并稍加修改，用取樣刀從牛排樣品中切取1 cm厚的均勻薄片，平置在潔凈的橡皮片上，用直徑為2.523 cm的圓形取樣器切取中心部肉樣，立即用感量為0.001 g的天平稱重(m1)，并記錄，然后放置于鋪有18層定性濾紙的壓力儀平臺上，肉樣上方再放18層定性濾紙，加壓至35 kg，保持5 min，中間不斷調節維持35 kg壓力。濾紙的層數可根據樣品保水性情況調整，以水分不透出、能夠全部吸凈為度。撤除壓力后，再次稱重記為m2。重復3次取平均值。失水率計算如公式(1)所示：

(1)

1.3.2 化學作用力的測定

1.3.3 肌肉蛋白質穩定性分析

參照DENG等[18]和LI等[13]的方法，將冷凍樣品(10～15 mg)在-20 ℃的封閉冷凍箱中制備，密封在鋁坩堝中并稱重。將樣品在20 ℃下靜置2 min，DSC儀器測定溫度為20～100 ℃，升溫速率5 ℃/min。用空坩堝作為熱分析的參考。使用儀器自帶軟件進行熱圖分析，其中確定了顯著吸熱峰的最高溫度Tmaxpeak，并計算熱變性焓DHpeak作為峰面積。

1.4 數據分析

數據采用IBM SPSS Statistics 20.0軟件以成熟時間、部位為固定因子，采用一般線性模型進行統計分析，用多重比較選擇比較主效應因素，采用Orign 2018軟件對數據作圖。所有結果以平均值±標準誤(mean±SE)的形式表示。

2 結果與分析

2.1 不同部位牛肉成熟過程中失水率變化

失水率，即加壓損失，反映肌肉中自由水的含量。如表1所示，成熟時間和部位對失水率影響極顯著(P<0.01)，部位和成熟時間的交互作用對失水率影響顯著(P<0.05)。可以看到，在整個成熟期間，半膜肌的失水率顯著高于背最長肌和腰大肌(P<0.05)，說明腰大肌的保水性顯著高于背最長肌和半膜肌(P<0.05)。成熟過程中，不同部位牛肉的失水率呈現先上升后下降趨勢(P<0.05)，在成熟3 d時達到最大值。

表1 不同部位牛肉成熟過程中失水率變化Table 1 The rate of pressure loss in different parts of beef during postmortem aging

2.2 不同部位牛肉成熟過程中化學作用力的變化

ZHANG等[12]研究發現，牛肉宰后成熟過程中蛋白質會發生降解。ZENG等[19]認為，肌纖維結構蛋白的完整性會對肉品的保水性具有顯著影響。離子鍵、氫鍵和疏水性相互作用力作為維持蛋白質三級結構的主要作用力，其值的變化可以反映蛋白質的變性程度[20]。

3種部位牛肉在成熟過程中離子鍵的變化如圖1所示，不同部位牛肉之間的離子鍵作用力均無顯著差別(P>0.05)，僅成熟時間對離子鍵作用力影響顯著(P<0.05)。在成熟前5 d離子鍵作用力變化不顯著(P>0.05)，成熟第7天時顯著升高(P<0.05)。

圖1 不同部位牛肉成熟過程中離子鍵作用力的變化Fig.1 Changes in ionic bond force in different parts of beef during postmortem aging注：不同字母表示不同成熟時間差異顯著(P<0.05)

圖2表示3種部位牛肉在成熟過程中氫鍵的變化。對于氫鍵作用力，部位、成熟時間和其交互作用對氫鍵作用力影響顯著(P<0.05)，在整個成熟期間內，背最長肌的氫鍵作用力1～3 d時顯著升高至7.84 mg/mL，在成熟5～7 d時降低至5.93 mg/mL，呈現先升高后降低的趨勢(P<0.05)，半膜肌和腰大肌的氫鍵作用力在成熟期間變化較復雜，但整體呈現為顯著上升的趨勢(P<0.05)。對比不同部位牛肉的氫鍵作用力，腰大肌的氫鍵作用力在成熟第2天和第5天時顯著低于背最長肌和半膜肌(P<0.05)。

圖2 不同部位牛肉成熟過程中氫鍵作用力的變化Fig.2 Changes in hydrogen bond force in different parts of beef during postmortem aging注：a～c不同字母表示同一部位不同成熟時間差異顯著(P<0.05)，x～y不同字母表示同一成熟時間不同部位差異著(P<0.05)

3種部位牛肉在成熟過程中疏水性相互作用力的變化如圖3所示。部位和成熟時間的交互作用對疏水性相互作用力影響顯著(P<0.05)，各部位牛肉疏水性相互作用力在成熟期間的變化各不相同，背最長肌的疏水性相互作用力在成熟第3天降低至2.21 mg/mL后在第7天升高至3.34mg/mL(P<0.05)。半膜肌的疏水性相互作用力在成熟前5 d無顯著變化(P> 0.05)，在成熟第7天降低至3.66 mg/mL(P<0.05)。腰大肌的疏水性相互作用力在1～3 d時由4.24 mg/mL顯著升高至6.91 mg/mL，在3～7 d顯著降低至4.66 mg/mL，呈現先升高后降低的趨勢(P<0.05)。在成熟前3 d，半膜肌的疏水性相互作用力顯著高于或不顯著低于背最長肌與腰大肌(P<0.05)；成熟3～5 d，各部位的疏水性相互作用力無顯著差異，維持在3.34～4.66 mg/mL。綜合分析來看，成熟期間3種部位牛肉的化學作用力均發生不同程度的變化(P<0.05)，且不同部位牛肉的化學作用力的變化幅度各不相同。

圖3 不同部位牛肉成熟過程中疏水性相互作用力的變化Fig.3 Changes in hydrophobic interaction force in different parts of beef during postmortem aging注：a～b不同字母表示同一部位不同成熟時間差異顯著(P<0.05)，x～y不同字母表示同一成熟時間不同部位差異顯著(P<0.05)

離子鍵、氫鍵和疏水性相互作用力作為維持蛋白質三級結構的主要作用力，其值的變化可以反映蛋白質的變性程度[16-17]。綜合分析來看，成熟期內3種部位牛肉的化學作用力均發生不同程度的變化(P<0.05)，且不同部位牛肉的化學作用力的變化幅度各不相同。康懷彬等[17]分析認為，蛋白質空間結構的改變會導致蛋白質內疏水性基團發生暴露，隨著蛋白質的變性，肽段的構象發生變化，同時生成了復雜的結構，進而降低了疏水性相互作用。總體而言，隨著蛋白質發生降解、價鍵被破壞，蛋白質原有的構象發生改變，蛋白質無序程度增加[17]。GMEZ-GUILLéN等[16]認為，相較于離子鍵作用力和氫鍵作用力，疏水性相互作用和二硫鍵等作用力在維持蛋白質空間結構時起主要作用。有研究表明蛋白分子作用力的變化與保水性具有一定關系。郭兆斌等[21]研究表明，蛋白質表面疏水性反映了蛋白質的水合特性，可以用來評價肌原纖維蛋白構象穩定性對保水性的影響；王靜宇等[22]研究表明，肌原纖維蛋白凝膠保水性受氫鍵、靜電相互作用、疏水相互作用和二硫鍵等相互作用力的影響。在本研究中，成熟期內3種部位牛肉的氫鍵作用力和疏水性相互作用力的變化和差異各不相同，離子鍵作用力僅第7天呈現顯著升高的趨勢(P< 0.05)，因此認為不同部位的牛肉蛋白質的化學作用力變化不同，化學作用力不是造成牛肉不同部位之間保水性差異的原因。

2.3 不同部位牛肉成熟過程中蛋白質穩定性的分析

根據1.3.3所述分析方法可得牛肉DSC變化的一般曲線，以此圖為例，可以說明牛肉中肌球蛋白、肌動蛋白和肌漿蛋白變性的一般規律(圖4)。DENG等[18]的研究表明，DSC熱流圖中出現的3種峰分別代表了肌球蛋白質頭部(峰I)、肌球蛋白尾部和肌漿蛋白(峰II)與肌動蛋白的變化(峰III)；峰的頂點溫度(Tmaxpeak)為蛋白質的變性溫度，反映了蛋白質的穩定性，Tmaxpeak越高，其穩定性越好；各峰的峰面積為蛋白質的變性焓(DHpeak)，反映了蛋白質的變性程度，焓值越高，說明蛋白質變性程度越小[13, 18]。

圖4 牛肉DSC曲線Fig.4 DSC curve of beef

由表2、表3可知，成熟時間與部位的交互作用對肌球蛋白頭部的變性溫度影響顯著(P<0.01)，其中背最長肌和半膜肌在整個成熟時間內雖整體下降，但下降不顯著(P>0.05)，腰大肌呈現顯著下降的趨勢，由55.03 ℃降低至54.14 ℃(P<0.05)。對于肌球蛋白頭部的焓變值DHpeakI，僅成熟時間和部位作用顯著(P<0.05)，交互作用不顯著(P>0.05)，其中腰大肌的焓變值(0.14 J/g)顯著低于背最長肌(0.15 J/g)與半膜肌(0.16 J/g)，說明腰大肌的肌球蛋白頭部更容易變性，且隨著成熟時間延長，3種部位牛肉DHpeakI的平均值由0.16 J/g降低至0.13 J/g(P<0.05)，表明3種部位牛肉的肌球蛋白頭部均發生變性。對于TmaxpeakII及其焓變DHpeakII，其變化趨勢與肌球蛋白頭部變性的情況相同，總體隨成熟時間呈現顯著降低的趨勢，且腰大肌的變性溫度(63.56 ℃)與焓變(0.28 J/g)均顯著低于背最長肌(63.94 ℃，0.31 J/g)與半膜肌(63.96 ℃，0.30 J/g)，表明腰大肌的肌球蛋白與肌漿蛋白更容易變性。

表2 不同部位牛肉成熟過程中蛋白質變性溫度的變化Table 2 The protein denaturation temperature in different parts of beef during postmortem aging

表3 不同部位牛肉成熟過程中蛋白質變性焓的變化Table 3 The thermal denaturation enthalpies in different parts of beef during postmortem aging

對于肌動蛋白的變化，雖然TmaxpeakIII隨成熟時間由第1天的77.56 ℃降低至第7天的77.49 ℃，整體呈現降低的趨勢，但變化不顯著(P>0.05)，且不同部位之間的差異性也不顯著(P>0.05)，變性焓值的差異和變化與TmaxpeakIII類似，表明在整個成熟期內(7 d)3種部位牛肉的肌動蛋白降解程度低且穩定性高。綜合整個DSC數據來看，在成熟期間內3種部位牛肉的肌原纖維均發生變性，且腰大肌的肌球蛋白與肌漿蛋白更易發生變性，且發生變性的程度更高。

在成熟過程中，細胞骨架蛋白(肌球蛋白、肌間線蛋白、肌動蛋白、肌聯蛋白等)的降解對保水性的影響至關重要[23-24]。研究表明，肉品成熟過程中保水性的降低與蛋白質的變性有關[25-27]。以上結果表明，3種部位相比，腰大肌中肌球蛋白和肌漿蛋白更易變性，而腰大肌的保水性較好(表1)，換言之，腰大肌中蛋白質變性程度的增加降低了牛肉可滲出的水分。因此，推測肌球蛋白與肌漿蛋白的變性可能促進了肌肉結構對汁液的維持，在外力作用如加壓狀態下，減少了牛肉可流失的汁液。BERTRAM等[28]研究表明，肌球蛋白和肌動蛋白的變性與肉中的水分變化具有一定關系。陳韜[29]認為，不同保水性樣品的肌球蛋白和肌漿蛋白的變性程度存在差異。在本研究中，成熟期間腰大肌的TmaxpeakI由55.03 ℃降低至54.14 ℃(P<0.05)，TmaxpeakII的均值為63.56 ℃，腰大肌的焓變值DHpeakI和DHpeakII也顯示出相同的趨勢，均顯著低于背最長肌和半膜肌(P<0.05)。腰大肌的肌球蛋白與肌漿蛋白變性程度均高于背最長肌和腰大肌(P<0.05)，而保水性的結果卻是腰大肌的保水性顯著高于背最長肌和半膜肌(P<0.05)，分析認為隨著成熟時間的延長，蛋白質降解、無序程度增加，肌細胞滯留水的能力更強[30]。因此蛋白質作為肌肉中固體物質的主要組成成分，蛋白質的變性對保水性起作用。

3 結論

在本研究中，成熟期內3種部位牛肉的氫鍵作用力和疏水性相互作用力的變化和差異各不相同，離子鍵作用力僅第7天呈現顯著升高的趨勢(P<0.05)，因此認為不同部位的牛肉蛋白質的化學作用力變化不同，化學作用力不是造成牛肉不同部位之間保水性差異的原因。DSC結果表明，腰大肌的蛋白質更易發生變性，且肌球蛋白和肌漿蛋白的蛋白質變性程度更高，蛋白質變性程度不同是引起不同部位之間牛肉保水性存在差異的原因。本研究通過探討蛋白質特性改變對保水性的影響，明確不同部位牛肉保水性存在差異的原因，為提高牛肉的保水性提供理論依據。