近平滑假絲酵母ATCC 7330羰基還原酶CpCR突變體酶的穩定性研究

龔大春，王德林，萬里，劉潤，呂育財，羅華軍，宋婷*

1(中國輕工業功能酵母重點實驗室(三峽大學)，湖北 宜昌，443002)2(三峽大學 生物與制藥學院，湖北 宜昌，443002)

羰基還原酶在功能有機酸[1-3]和手性羥基化合物[4-6]合成中具有巨大的應用前景，但是該酶在耐熱、耐溶劑、耐剪切等方面的穩定性有待進一步提高[7-9]。曹塊[10]發現羰基還原酶存在熱穩定性差、半衰期(t1/2)短，機械攪拌會加速酶失活等不足，GROSCH等[11]研究發現近平滑假絲酵母的羰基還原酶CPCR2界面穩定性差異較大，在單一的有機相如乙醇中很穩定，但在溶液-有機溶劑構成的雙相體系中不穩定。宋婷等[12]也研究發現近平滑假絲酵母ATCC 7330羰基還原酶wtCpCR的界面穩定性和耐熱性較差。因此為了提高該羰基還原酶在食品工業和生物化工應用價值，亟待改善其穩定性。

蛋白質工程及定點突變技術的快速發展[11，13-20]，為提高酶的熱穩定性、耐溶劑能力、耐酸能力等提供了高效的方法[17-25]。劉曉慧等[26]采用定點突變對氨基甲酸乙酯水解酶進行Q328C和Q328V分子改造后，將該酶40 ℃下的t1/2分別提高了7.46、1.99倍。郭超等[27]通過分子改造牛腸激酶得到R87P突變體酶的t1/2和T50較野生型分別提高了3.1 min和11.8 ℃。JAKOBLINNERT等[28]對羰基還原酶的A275和L276進行單突變和雙突變，在環己烷-緩沖水溶液體系中酶活力提高1.5倍，熱穩定性也提高2.7 ℃。沈瑞華等[29]構建的腈水合酶突變體M150C、T173Y和S189E在50 ℃下t1/2分別增加了32%、7%和107%，熔融溫度(melting temperature，Tm)提高1～3 ℃。但利用定點突變技術對近平滑假絲酵母ATCC 7330羰基還原酶wtCpCR開展分子改造和穩定性研究還未見報道。

因此本文擬通過蛋白質理性設計和定點突變技術，篩選羰基還原wtCpCR與輔酶結合的柔性區域氨基酸殘基突變位點，構建系列羰基還原酶突變體，研究其在界面穩定性、耐氧能力、耐剪切力和耐熱等方面的特點，為拓展其在手性化合物和食品添加劑中的應用奠定科學基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌株CandidaparapsilosisATCC 7330、EscherichiacoilBL21(DE3)，本實驗室保存；T4連接酶、質粒抽提試劑盒、產物純化試劑盒，Vazyme生物技術有限公司；DL 10 000 bp Marker、蛋白質電泳Marker、6×loading Buffer、5×蛋白上樣緩沖液，TAKARA有限公司；質粒載體pACYCDuet-1，北納創聯生物科技有限公司；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside，IPTG)，純度>99.9%，Calbiochem公司；PCR引物合成及測序，生工(上海)生物技術有限公司；Ni-Agarose His標簽蛋白純化試劑盒，北京康為世紀生物科技有限公司；其他試劑為國產或進口分析純。

NanoDrop One超微量紫外可見分光光度計，Thermo Fisher Scientific；C1000 TouchPCR儀、Doc XR+Gel凝膠成像儀，伯樂生命醫學產品有限公司(Bio-Rad)；SX-700蒸汽滅菌器、MX-307落地高速冷凍離心機，Tomy Digital Biology；SW-CJ-2FD超凈工作臺，蘇州凈化設備有限公司；UV1800紫外可見分光光度計，島津企業管理有限公司；Discovery Studio 2017版軟件，北京創騰科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 羰基還原酶的突變點篩選

將近平滑假絲酵母ATCC 7330羰基還原酶蛋白(PDB數據庫代號為4OAQ)分別與4-氯苯基甲酮和4-氯-3-酮基丁酸乙酯等不同底物采用Discovery studio 2017軟件進行CDOCKER對接，通過模擬及文獻[11]報道的羰基還原酶雙相催化體系的鈍化機理和穩定性推測，得到控制羰基還原酶wtCpCR耐溶劑、耐剪切、耐氧等穩定性的主要氨基酸有Ala98、Ser307、Gly262、Ser216和Ser258，除了Ser307外，其他均位于該酶的柔性區域。對這5個氨基酸采用飽和突變，計算突變能。得到5個突變體自由能，分別是ALA98Asn(-13.56 kJ/mol) 、Ser307Asn(-12.60 kJ/mol) 、Gly262Asn(-5.53 kJ/mol)、Ser216Asn(-5.15 kJ/mol)、Ser258Asn(-5.40 kJ/mol)。根據突變自由能比較[ΔΔGmut=ΔΔGfold(mutant)-ΔΔGfold(wild type)]，這些突變體的突變能均為-4.186 kJ/mol以下，因此預測這些突變體酶的穩定性會有所提高。

1.2.2 定點突變引物設計、構建突變體文庫、制備突變體酶

根據羰基還原酶wtCpCR的基因序列，利用SnapGene軟件開展引物設計，如表1所示，用Mut Express Ⅱ Fast Mutagenesis Kit V2方法進行定點突變，得到突變質粒，轉化到E.coliBL21(DE3)感受態細胞，構建突變文庫，經測序驗證后，再進行菌種培養、分離純化得到相應突變體酶A98N、S307N、G262N、S216N、258N。

表1 定點突變引物設計表Table 1 Primer design table for site-directed mutagenesis

1.2.3 wtCpCR及其突變體酶的酶活力測定

突變體酶與wtCpCR的酶活力的測定參照文獻[12]，采用分光光度計法。酶活力測定的一般方法：總反應體積為1 mL，包含750 μL 100 mmol/L磷酸緩沖液(phosphate buffer，PB)(pH 7.5)，100 μL 20～40 mmol/L帶酮基或醛基底物，100 μL 2 mmol/L NADPH，30 ℃溫育3 min，最后加入50 μL酶液，在340 nm條件下測定吸光度值的變化。本實驗選用苯甲醛作為底物。

酶活力定義：在30 ℃、pH 7.5條件下，1 min催化氧化1 μmol NADPH所需要的酶量定義為1 U。酶活力計算如公式(1)所示：

(1)

式中：ΔA為初速度范圍內每分鐘吸光度值差值，min-1；V總為總反應體積，mL；n為酶液稀釋倍數；6.22 為NADPH的消光系數，mmol/ (L·cm)；d為比色皿直徑，1 cm；V為酶液添加體積，mL。

1.2.4 突變體酶的穩定性研究

1.2.4.1 不同雙相體系對羰基還原酶突變體的界面穩定性影響

建立PB-正己烷、PB-甲基叔丁基醚兩種雙相體系，檢測wtCpCR及其突變酶在PB水相和雙相體系條件下的酶活力變化，研究wtCpCR突變酶的界面穩定性變化規律。雙相體系由1 mL的正己烷(或甲基叔丁基醚)和1 mL的酶溶液(0.1 mol/L PB，pH 7.5)組成。水相體系由1 mL PB和1 mL酶溶液組成。將單相或雙相體系放入50 r/min、30 ℃的水浴鍋中進行溫育。定時取樣，按照1.2.3酶活力測定方法測定剩余酶活力，確定各種酶在不同體系中的半衰期(t1/2)。所有實驗重復3次，數據用Origin 8.0軟件處理(下同)。

1.2.4.2 不同溫度對羰基還原酶突變體的熱穩定性影響

取適量酶液，置于4～50 ℃條件下保溫2 h，移取部分酶液，按照1.2.3酶活力測定方法測定不同溫度條件下剩余酶活力，計算該酶的T50值，考察該酶溫度穩定性變化特點。T50的定義：酶活力降低至初始酶活力的50%時所對應的溫度。

1.2.4.3 氧氣對羰基還原酶突變體穩定性的影響

將經過無氧處理(在厭氧箱中進行氮氣置換，以保證無氧條件)和未處理的酶溶液(0.1 mol/L PB，pH 7.5)放置在30 ℃條件下溫育，每隔4 h取樣 1次，按照1.2.3酶活力測定方法測定剩余酶活力，確定酶在無氧和有氧條件下的t1/2，研究酶在厭氧和有氧條件下的變化規律。

1.2.4.4 剪切力對羰基還原酶突變體穩定性的影響

在適當稀釋的酶溶液(0.1 mol/L PB，pH 7.5)中加入5 mm聚四氟乙烯磁力攪拌子，并放置在30 ℃條件下溫育，分別設置100、200、300 r/min 3種不同的轉速條件。每隔2 h取樣1次，按照1.2.3酶活力測定方法測定剩余酶活力，確定酶在不同剪切力強度下的t1/2，研究酶的耐剪切能力。

1.2.4.5 輔酶NADPH對羰基還原酶突變體的穩定性的影響

添加不同濃度的輔酶NADPH，通過測定酶活力的變化，研究輔酶對wtCpCR及其突變酶酶活力穩定性的影響。在酶溶液(0.1 mol/L PB，pH 7.5)中加入輔酶NADPH至終濃度分別為0.002、0.02、0.2、0.4 mmol/L，并放置在30 ℃條件下溫育。每隔4 h取樣，按照1.2.3酶活力測定方法測定剩余酶活力，確定酶在不同輔酶濃度條件下的t1/2。

2 結果與分析

2.1 突變體酶的比酶活變化

以wtCpCR為參照，不同突變體酶的相對比酶活力結果如圖1所示。實驗表明，A98N的比酶活力為14.52 U/mg，比野生酶提高了10%，說明第98位丙氨酸突變為天冬酰胺后得到的突變體酶可以增加其在PB中的催化能力。其余的突變體酶的比活力均有不同程度的減小。G262N、S258N的比酶活力下降為原始酶的66%和83%，S216N的比酶活力降低至原來的18%，而S307N未檢測到酶活力，說明307位的絲氨酸是關鍵活性位點。因此選擇G262N、S216N、S258N、A98N 4個突變體酶進行后續相關研究。

圖1 wtCpCR與5個突變體酶的相對比酶活力Fig.1 Relative specific activity between wtCpCR and 5 mutants

2.2 wtCpCR及突變酶的穩定性研究

2.2.1 wtCpCR及突變酶的雙相界面穩定性變化特點

研究發現，wtCpCR在PB、PB-正己烷、PB-甲基叔丁基醚3種溶劑體系的t1/2依次下降，特別是PB-甲基叔丁基醚的雙相體系中，該酶在25.9 min已下降為初始酶活力的一半，說明甲基叔丁基醚溶劑對酶的三維空間折疊影響很大，對酶有較強的毒性，導致酶快速失活。從圖2-a可以看出，所有的突變體酶在PB-正己烷體系中的t1/2變短。但在PB單相體系中，G262N、S258N、A98N的t1/2均有增長，穩定性均增加。而這4個突變體酶在PB-甲基叔丁基醚體系中的t1/2差異較大(圖2-b)，其中A98N和G262N的t1/2延長，t1/2值分別是wtCpCR的1.7和1.4倍。表明98和262位置上的氨基酸是提高該酶在PB-甲基叔丁基醚體系中的界面穩定性關鍵氨基酸，通過分子改造后可以增強CpCR酶耐醚類溶劑的能力，對拓展該酶的工業化應用具有重要價值。

a-PB、PB-正己烷；b-PB-甲基叔丁基醚圖2 wtCpCR和4種突變酶在PB、PB-正己烷和PB-甲基叔丁基醚的半衰期變化Fig.2 The t1/2 of wtCpCR and 4 mutants in PB, PB-n-hexane and PB-methyl tert-butyl ether

2.2.2 wtCpCR及其突變酶的熱穩定性特點

在4～50 ℃的溫度下，研究了wtCpCR和突變體酶的熱穩定性。從圖3可以看出，4個位點的突變均對酶的熱穩定性有一定的影響，T50值略有下降，其中S216N的T50值為31 ℃，下降較大，耐溫性降低；而G262N的T50值與wtCpCR接近，為36 ℃，較wtCpCR下降1 ℃。

圖3 wtCpCR和4種突變酶的T50變化Fig.3 Change of T50with wtCpCR and 4 mutants

2.2.3 剪切力對wtCpCR和突變體酶穩定性的影響

按照1.2.4.4方法研究100、200、300 r/min 3個不同剪切強度對wtCpCR及其突變酶的穩定性的影響，相對穩定性如圖4所示。研究發現，隨著剪切力的增加，wtCpCR和突變體酶的t1/2也下降。但在300 r/min的高剪切力下，G262 N和A98 N的穩定性比原始酶wtCpCR好，t1/2值是wtCpCR的1.3倍，G258 N突變體在高剪切力作用下酶的穩定性下降較多。說明對wtCpCR在262、98位開展定點突變，能提高酶的耐剪切能力。

圖4 wtCpCR和4種突變酶在不同剪切力強度下的相對穩定性Fig.4 The relative stability of wtCpCR and four mutant enzymes under different shear force stress

2.2.4 氧對wtCpCR和突變體酶穩定性的影響

氧對G262N和A98N兩種突變體酶穩定性的影響結果如圖5所示。wtCpCR在無氧條件下的穩定性比有氧條件要好；但經過定點突變得到的突變酶G262 N在有氧條件下的穩定性更好，其中t1/2值為11.87 h，耐氧能力比野生酶提高1.4倍；無氧條件下，兩個突變體酶的穩定性均有不同程度下降。

圖5 有氧和無氧條件下wtCpCR和突變體酶的半衰期變化Fig.5 The t1/2 of wtCpCR and mutant enzymes under aerobic and anaerobic circumstances

2.1.5 輔酶NADPH濃度對wtCpCR和突變體酶的穩定性的影響

按照1.2.4.6的方法測定了0～0.4 mmol/L濃度的輔酶NADPH對酶的穩定性影響。如圖6所示，wtCpCR和突變體酶G262N、A98N均隨著輔酶NADPH濃度的升高，t1/2也延長，穩定性增強。在整個考察的輔酶濃度區間突變體G262N酶更加穩定，表明262位的甘氨酸是提高CpCR酶穩定性的關鍵氨基酸。

圖6 不同輔酶NADPH濃度對突變體酶的穩定性影響Fig.6 The effect of different concentration about NADPH on the stability of mutants

3 結論

本實驗通過蛋白質理性設計和定點突變技術成功得到5個突變體酶A98N、S307N、G262N、S216N和S258N。實驗結果表明，以wtCpCR的比活力為參照，突變體酶A98N比活力提高了10%。在酶的穩定性實驗結果表明，A98N和G262N在PB-甲基叔丁基醚的雙相體系中酶的t1/2延長，耐溶劑穩定性比原始酶wtCpCR分別提高1.7、1.4倍；4個突變體酶的耐熱特性均沒有提高，T50值為31～36 ℃，T50值與wtCpCR最接近的是G262N；在300 r/min條件下，突變體酶G262N和A98N的穩定性比wtCpCR好，t1/2值是wtCpCR的1.3倍；突變酶G262N在有氧條件下的穩定性更好，其中t1/2值為11.87 h，耐氧能力比wtCpCR強1.38倍；輔酶濃度為0～0.4 mmol/L時，G262N酶更加穩定。綜上分析，突變體A98N和G262N在耐醚類溶劑、耐剪切力具有提高，G262N突變體在有氧和輔酶濃度區域穩定性更好。本研究不僅為該酶的98位和262位的雙點突變和酶穩定性進一步改造提供重要的科學依據，而且為提高該酶雙相體系生物催化工藝經濟性提供重要保障。