金雀異黃酮通過抑制黃嘌呤氧化酶延緩結腸腫瘤發展

李紅領，李海濤

(江南大學 食品學院，江蘇 無錫，214122)

結腸相關癌癥(colorectal cancer，CRC)占美國癌癥致死的第3位，5年生存率大概是14%[1]。在世界范圍內，以美國和歐洲為首的發達國家發病率較高，從1975年開始，美國結腸癌發病率呈下降趨勢，但年輕人的發病率有所升高；非洲和亞洲國家的發病率較低，但是，隨著中國經濟的迅速發展，結腸癌發病率呈逐年遞增趨勢[2]。結腸癌主要分為兩類，第一類是散發性結腸癌(sporadic colorectal cancer，SCRC)，主要發展機制是一系列基因突變的結果，其中腺瘤性息肉病(adenomatous polyposis coli，APC)基因失活是SCRC的起因；第二類是炎癥相關的結腸癌(colitis-associated cancer，CAC)，其發病機制尚不明確，有些研究認為，炎癥引起結腸上皮細胞中的氧化應激導致DNA損傷是這類結腸癌變的起因[3-4]。癌癥化學預防的定義是通過使用天然，合成或生物化學試劑來逆轉，抑制或預防癌癥的發展[5]。結腸腫瘤發生的多步驟性為預防提供了機會[6]。環氧合酶2(cyclooxygenase2，COX2)是預防結腸癌最有希望的分子靶標，但臨床試驗表明，長期抑制COX2會引起心血管毒性[7]。治療癌癥的一些藥物，例如5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)和他莫昔芬等，會出現耐藥性，高風險復發等副作用。因此，近年來人們開始關注有效改善化學療法，并降低不良反應的自然療法[8]。長期攝入嘌呤含量高的食物，例如海鮮，啤酒等可以引起高尿酸血癥，進而引起痛風性關節炎和高尿酸腎病，黃嘌呤氧化酶(xanthine oxidase, XO)是治療這些疾病的主要靶點[9]。最近的研究表明，XO可以促進腫瘤的發展[10]，得益于XO在痛風中的研究結果，黃酮類物質展示出對XO抑制的巨大潛力[11]；另一方面，流行病學證據表明，大豆異黃酮可預防結直腸癌的發展[12-14]。綜上所述，具有抑制XO作用的黃酮類化合物可能有預防結腸癌的潛力。因此，本研究首先通過HPLC的方法，體外篩選XO的抑制劑；然后建立氧化偶氮甲烷(azoxymethane，AOM)/葡聚糖硫酸鈉(dextran sulfate sodium，DSS)誘導的小鼠結腸癌模型評價這些抑制劑的體內效果。研究成果表明，金雀異黃酮可以通過抑制XO有效延緩結腸癌的發展。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實驗動物

SPF級C57BL/6 N雄性小鼠，5周齡(體重20～22 g)，北京維通利華實驗動物技術有限公司。

1.1.2 抗體

重組Anti-Xanthine Oxidase抗體(ab109235)、重組Anti-TNFα抗體(ab81299)，Abcam。

1.1.3 實驗試劑

還原性谷胱甘肽(glutathione，GSH)、尿酸試劑盒，南京建成生物工程研究所；XO活性檢測試劑盒，北京索萊寶科技有限公司；Mouse TNFα ELISA Kit、Mouse IL-6 ELISA Kit，南京福麥斯生物技術有限公司；免疫組化試劑盒，生工生物工程股份有限公司；AOM，無錫萊弗思生物有限公司；DSS，南京百思凱科技有限公司；XO、別嘌呤醇(allopurinol)、尿酸(uric acid)、黃嘌呤(xanthine)，Sigma公司;黃酮類(flavones)：芹菜素(apigenin)、白楊素/柯因(chrysin)，黃酮醇類(flavonols)：高良姜素(galangin)、山奈酚(kaempferol)、槲皮素(quercetin)、漆黃素(fisetin)、桑色素(morin)，異黃酮類(isoflavones)：金雀異黃酮(genistein)、黃豆苷元(daidxein)，黃烷酮類(flavanones)：二氫黃酮甙(hesperiden)、柚皮素(naringenin)，類黃酮醇(flavanonols)：花旗松素(taxifolin)，酚酸類(phenolic acids)：綠原酸(chlorogenic acid)、咖啡酸(caffeic acid)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 HPLC法篩選XO的有效抑制劑

利用XO催化黃嘌呤氧化生成尿酸這一反應。首先在1.5 mL EP管中加入終濃度為100 μmol/L的抑制劑和20 μL、0.1 U/mg prot的XO，在PBS(PH 7.5)緩沖溶液里室溫下反應15 min，然后加入330 μL 150 μmol/L黃嘌呤，反應30 min后加入100 μL 1 mol/L鹽酸終止反應；PBS和別嘌呤醇(10 μmol/L)分別作為空白和陽性對照。反應后的溶液經0.22 μm的濾膜過濾后，HPLC法檢測產物尿酸的峰面積，為保證數據的準確性，需進行3次平行重復實驗[15]。因有些化合物的光不穩定性較差，整個過程需注意避光，利用公式(1)計算XO的活性。

(1)

HPLC的檢測方法：流動相為0.1 mol/L磷酸二氫鈉水溶液，流速為0.8 mL/min，室溫，ODS-C18柱(150 mm×4.6 mm,5 μm)，檢測波長為290 nm，液相色譜儀為Q Exactive LC (Thermo Fisher)。

1.2.2 利用AOM/DSS誘導原發結直腸癌腫瘤小鼠模型實驗

5周齡SPF級C57BL/6 N雄性小鼠，飼養于江南大學實驗動物中心SPF屏障環境中，實驗編號為：JN.No20181230c1250401 [279]。小鼠在屏障環境中適應喂養1周后，隨機分為4組，每組12只，分別為空白組、模型組和實驗組，其中實驗組包括低劑量金雀異黃酮組(20 mg/kg)和高劑量金雀異黃酮組(40 mg/kg)。分組后，模型組和實驗組小鼠腹腔注射AOM(10 mg/kg，200 μL)，空白組注射相同體積的9 g/L NaCl溶液。1周后，模型組和實驗組小鼠接受含有3% DSS飲用水[16]，持續1周，同時開始給與實驗組小鼠灌胃低劑量和高劑量金雀異黃酮，空白組和模型組灌胃相同體積的NaCl溶液。模型組和實驗組小鼠停止給與DSS后，用普通的飲用水繼續喂養6周。實驗結束后，收集血清，結腸，肝脾等組織，用于后續實驗。其中每組6只小鼠的結腸放于液氮中保存，用于測量生化指標，其余6只小鼠的結腸，用4%多聚甲醛固定，用于蘇木精- 伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色法和免疫組化(immunohistochemistry，IHC)分析。

1.2.3 小鼠結腸組織固定和HE染色

用于HE和IHC分析的結腸組織，用冷的PBS沖洗干凈后，縱切后平鋪在試驗臺上，從遠端結腸開始卷起，直到盲腸，“瑞士卷”做好后，放入4%多聚甲醛中固定，經脫水、透明、浸蠟和包埋后，制成5 μm的切片，經HE染色，于顯微鏡下觀察拍照，對異常隱窩病灶和腫瘤計數。

1.2.4 IHC分析

結腸組織切片經過烤片、脫蠟、復水后，經3%體積分數的過氧化氫溶液中浸泡10 min滅酶，檸檬酸鈉溶液中微波加熱6 min完成抗原修復，冷卻至室溫，使用5% BSA溶液室溫封閉1 h，切片放入恒濕盒內，并在4 ℃層析柜內孵育一抗(XO、TNFα抗體，1∶200稀釋)，過夜，然后按IHC試劑盒說明書完成染色和蘇木精復染等后續實驗，并在掃描顯微鏡下拍照分析XO和TNFα的表達水平和定位。

1.2.5 小鼠結腸部位TNFα,IL-6和GSH含量測定

液氮保存的結腸樣品，加入20倍體積PBS，組織研磨后，12 000 r/min，30 min，4 ℃離心收集上清液，如果上清液脂肪過多，需再次離心，重新收集上清液，避免上清液脂肪影響實驗結果的準確性。取部分上清液經5倍稀釋后，用BCA法測蛋白濃度；取另外一部分上清液，檢測結腸部位IL-6，TNFα和GSH含量，IL-6和TNFα的含量嚴格按照說明書所提供的酶聯免疫方法進行檢測，GSH含量嚴格按照說明書所提供的生化微板法進行檢測，檢測結果用蛋白含量進行標定。其余上清液放入-80 ℃冰箱備用。

1.3 統計分析

采用平均值±標準差表示實驗結果，使用Graph Pad Prism 5.0統計軟件包進行統計分析。Turkey′st-test 檢驗用于比較2組之間的數據；One-way ANOVA和Bonferroni校正用于比較3個或更多組之間的數據。對于P<0.05 的分析結果，認為具有顯著性差異，其中*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001。

2 結果與分析

2.1 金雀異黃酮體外抑制XO的活性

通過HPLC篩選的方法，分別評價了12種黃酮類化合物和2種酚酸類化合物對XO活性的影響，結果見圖1，陽性對照別嘌呤醇組XO活性為(1.5±0.7)%，芹菜素和金雀異黃酮對XO活性抑制顯著，XO的活性分別為(26.3±3.3)%(P<0.01)和(9.8±0.3)%(P<0.001)；進一步考察了金雀異黃酮對XO活性抑制的劑量依賴效應，結果見圖2，10、30、100 μmol/L金雀異黃酮組的XO活性分別為(82.2±3.1)%(P>0.05)，(61.2±1.1)%(P<0.05)和(10.9±1.5)%(P<0.001)，金雀異黃酮表現出對XO活性抑制的劑量依賴效應。

A-黃酮和酚酸類物質的結構式；B-黃酮和酚酸類物質對黃嘌呤氧化酶催化黃嘌呤產生尿酸活性的影響圖1 黃酮和酚酸類化合物對 XO 活性的影響Fig.1 The effect of flavonoids and phenolic acids on the activity of xanthine oxidase注：*表示P<0.05,**P<0.01,***表示P<0.001(下同)

2.2 金雀異黃酮抑制小鼠結腸癌的發展

通過建立AOM/DSS誘導原發結直腸癌腫瘤小鼠模型，評價了不同濃度金雀異黃酮對結腸腫瘤的預防作用，圖3-A為實驗方案設計。圖3-B顯示各組小鼠的體重分別是，空白組(27.6±2.0)g，模型組(26.1±1.5)g，低劑量金雀異黃酮組(25.7±1.9)g，高劑量金雀異黃酮組(25.2±2.1)g。實驗組小鼠較空白和模型組小鼠的體重有所下降，但無顯著性差異(P>0.05)，通過結腸長度和肝指數(圖3-C和圖3-D)可以看出，小鼠表現出對金雀異黃酮的耐受，無明顯的肝毒性。圖3-E表明模型組的脾指數顯著高于空白組(P<0.001)，高劑量的金雀異黃酮可以顯著抑制AOM/DSS引起的脾指數升高(P<0.001)。AOM/DSS模型組小鼠結腸組織中的腫瘤數目(P<0.01)，TNFα(P<0.05)和IL-6(P<0.05)水平較空白組顯著升高，高劑量的金雀異黃酮顯著降低結腸部位的腫瘤數目(P<0.05)和TNFα水平(P<0.05)(圖3-F～圖3-H)。這些結果表明高劑量金雀異黃酮可以抑制AOM/DSS引起的結腸炎癥相關癌癥的發展。

A-不同濃度的金雀異黃酮對黃嘌呤氧化酶活力的影響；B-HPLC法檢測金雀異黃酮對黃嘌呤氧化酶催化黃嘌呤產生尿酸的影響圖2 金雀異黃酮對 XO 活性抑制的劑量依賴效應Fig.2 The dose-dependent effect of genistein on the inhibition of xanthine oxidase activity

2.3 金雀異黃酮通過抑制XO活性延緩結腸腫瘤的發展

最近的研究表明，XO可促進腫瘤的發展[10]，鑒于金雀異黃酮在體外顯示出對XO的抑制作用，金雀異黃酮抑制小鼠結腸癌發展的靶點可能是XO。圖4中IHC結果表明小鼠結腸腫瘤部位的XO和TNFα蛋白水平升高，XO在間質和黏膜中均有表達，TNFα主要在間質表達。AOM/DSS誘導的模型組小鼠結腸部位XO活性(P<0.01)和產物尿酸的水平(P<0.05)較空白組顯著升高，高劑量金雀異黃酮顯著抑制結腸部位XO(P<0.05)和尿酸水平(P<0.05)，并顯著提高了GSH水平(P<0.05)。這些結果表明金雀異黃酮通過抑制XO活性延緩結腸腫瘤的發展。

A-黃嘌呤氧化酶在結腸腫瘤中的定位；B-小鼠結腸黏膜中XO活性；C-結腸黏膜中尿酸含量；D-金雀異黃酮對AOM/DSS誘導小鼠結腸黏膜中GSH含量影響圖4 不同濃度金雀異黃酮對結腸癌模型小鼠中 XO 的影響Fig.4 The effect of different concentrations of genistein on xanthine oxidase in colon cancer mice

3 討論

別嘌呤醇可以通過竟爭性抑制XO的活性來治療痛風等疾病，但會出現過敏性皮疹、腹痛腹瀉等不良反應，因此這種藥物在臨床上的應用飽受非議[9]。近年來，隨著不斷深入研究，發現天然產物中一些黃酮類化合物可有效抑制XO的活性[11]。本文通過HPLC的方法評價了12種黃酮類和2種酚酸類對XO活性的影響，發現金雀異黃酮可以顯著抑制XO活性，并具有明顯的劑量依賴，這可能與金雀異黃酮A環上5和7位的羥基和C環上3位的苯酚基團有關，但是金雀異黃酮是如何抑制XO及抑制類型需進一步研究確認。

在體內，金雀異黃酮也可以抑制AOM/DSS小鼠結腸癌模型中結腸部位XO活性，并減少結腸部位小鼠腫瘤的數目。這些結果表明，金雀異黃酮可以通過抑制XO有效延緩結腸癌的發展。值得注意的是，金雀異黃酮降低了AOM/DSS小鼠結腸癌模型中尿酸含量，升高了結腸部位的GSH含量，這個結果顯示金雀異黃酮可能是通過降低尿酸或者緩解結腸部位的氧化應激而延緩結腸癌的發展。氧化應激引起的組織損傷長期以來一直與結腸炎相關的結腸腫瘤發生有關，但其分子機制仍不清楚[17]。最近的研究表明，過量的尿酸對機體是一種危險信號，參與機體的炎癥反應[18-19]。因此，XO具體是通過哪種代謝產物促進了結腸癌的發展還需進一步研究。

綜上，本研究通過HPLC的方法，篩選到金雀異黃酮可有效抑制XO，并延緩AOM/DSS引起的小鼠結腸癌的發展。臨床數據也表明，金雀異黃酮與抗癌藥物，例如阿霉素，多西他賽，和他莫昔芬聯合使用時，展現出明顯的協同作用[20-21]。這些結果表明，金雀異黃酮具有潛在的臨床治療或者聯合其他抗癌藥物預防結腸癌的作用。