嗜黏蛋白阿克曼氏菌ATCC BAA-835腸道益生作用的體外評(píng)價(jià)

吳艷麗，劉朋，蘇詠欣，李恒,2*，耿燕,2，任怡琳，許泓瑜，許正宏,4，史勁松,2*

1(江南大學(xué) 生命科學(xué)與健康工程學(xué)院，江蘇 無錫，214122)2(糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫，214122)3(糧食發(fā)酵與食品生物制造國家工程研究中心，江蘇 無錫，214122)4(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫，214122)

嗜黏蛋白阿克曼氏菌(Akkermansiamuciniphila，Akk)是定植于腸道黏液層中可特異性降解黏蛋白的革蘭氏陰性厭氧菌[1]。研究發(fā)現(xiàn)，Akk具有良好的調(diào)節(jié)代謝的能力，口服Akk可改善動(dòng)物脂代謝和腸道通透性，起到預(yù)防肥胖和改善脂多糖內(nèi)毒素血癥的作用[2]。初步的臨床實(shí)驗(yàn)也表明，Akk安全性良好，適量補(bǔ)充可顯著降低超重和肥胖患者的胰島素分泌和總膽固醇水平，減輕胰島素抵抗[3]。此外，在炎癥性腸病[4]、糖尿病[5]、自閉癥[6]、癲癇[7]、高血壓[8]等疾病中也相繼報(bào)道了Akk改善疾病癥狀的作用。Akk與機(jī)體腸道生態(tài)、代謝、神經(jīng)等生理狀態(tài)密切相關(guān)，具有良好的腸道益生作用。

借助大規(guī)模基因組測(cè)序分析，Akk發(fā)揮腸道益生作用的機(jī)制與其顯著調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)之間的關(guān)聯(lián)已逐步揭示。多項(xiàng)人體與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，肥胖、糖尿病、炎癥和代謝紊亂等疾病的發(fā)生發(fā)展均伴隨不同程度的Akk豐度的降低[9]。不僅如此，Akk對(duì)腸道上皮細(xì)胞良好的黏附作用以及自聚集能力，有利于在腸道菌群中形成優(yōu)勢(shì)占位[10]，這也為其參與調(diào)節(jié)代謝穩(wěn)態(tài)及相關(guān)途徑基因表達(dá)提供基礎(chǔ)。目前，有關(guān)Akk益生性能的研究大多采用測(cè)序的方法從群落水平上進(jìn)行分析，鮮有研究從菌株水平進(jìn)行探討。本研究即借助微生物純培養(yǎng)與細(xì)胞模型等體外研究方法，對(duì)Akk進(jìn)行益生性能的考查和評(píng)價(jià)，進(jìn)一步了解Akk發(fā)揮腸道益生作用的微生物學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

Akk模式菌株，購自ATCC菌種保藏庫(ATCC BAA-835)；Caco-2細(xì)胞，江南大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤研究所殷媛博士饋贈(zèng)。

甘露寡糖(聚合度2～7)，成都永安緣和生物科技有限公司；殼寡糖(聚合度2～7)，揚(yáng)州日興生物科技有限公司；褐藻寡糖(聚合度2～7)，實(shí)驗(yàn)室自行制備；溶菌酶、胰蛋白酶、腦心浸液(brain heart infusion，BHI)、黏蛋白、L-半胱氨酸、3,5-二硝基水楊酸(3,5-dinitrosalicylic acid，DNS)、丙三醇、氫氧化鈉，美國sigma公司。

1.1.2 培養(yǎng)基及溶液配制

BHI培養(yǎng)基(g/L)：BHI 37.0、黏蛋白5.0、L-半胱氨酸0.3。121 ℃，滅菌20 min后備用。

低聚糖培養(yǎng)基：甘露寡糖、殼寡糖和褐藻寡糖分別配制1 mg/mL母液，采用0.22 μm濾膜過濾除菌，加入BHI培養(yǎng)基中分別配制低聚糖質(zhì)量濃度為250、500、1 000 μg/mL的3種含糖培養(yǎng)基，滅菌備用。

膽鹽培養(yǎng)基：BHI培養(yǎng)基中加入膽鹽，使膽鹽在液體培養(yǎng)基中的最終質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1.0%、1.2%、1.4%、1.6%，滅菌備用。

Akk培養(yǎng)條件：厭氧工作站培養(yǎng)，37 ℃，氣體組成為80% CO2，10% H2，10% N2。

1.1.3 溶液配制

人工胃液的配制：用鹽酸調(diào)整蒸餾水的pH值至3.5，加入胃蛋白酶，使其質(zhì)量濃度為10 mg/mL，用0.22 μm的濾膜進(jìn)行過濾除菌后得到人工胃液。

人工腸液的配制：取磷酸二氫鉀6.8 g，加水500 mL溶解，用0.4%氫氧化鈉溶液調(diào)整pH值至7.0；另取胰蛋白酶10 g，加水適量溶解，將兩液混合后，加水稀釋至1 000 mL，0.22 μm的微孔濾膜過濾除菌后制得人工腸液。

DNS的配制：稱取244.4 g酒石酸鉀鈉于500 mL去離子水中，45 ℃加熱溶解。向溶液中加入21 g氫氧化鈉，然后加入DNS 6.3 g，溶解后分別加入5 mL苯酚和5 g亞硫酸氫鈉，待溶液冷卻后定容至1 L，置于棕色瓶中避光貯存1周后備用。

1.1.4 儀器與設(shè)備

DG250厭氧培養(yǎng)工作站，Don Whitley Science公司；酶標(biāo)儀，Bio-Rad公司；UltiMate3000高效液相色譜儀，戴安(中國)有限公司；SU8220場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡(field emission scanning electron microscope，F(xiàn)ESEM)，日本HITACHI公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌種活化與培養(yǎng)

在超凈工作臺(tái)中，蘸取保存管中的菌液，平板劃線后在厭氧工作站中37 ℃靜置過夜培養(yǎng)。挑取平板上的單菌落接種于液體培養(yǎng)基中活化24 h，再按 5.0%的接種量進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。

1.2.2 Akk對(duì)模擬胃腸環(huán)境耐受性評(píng)價(jià)

模擬胃腸液耐受性：將Akk發(fā)酵液按體積比1∶10加至模擬胃液中，37 ℃恒溫靜置培養(yǎng)，分別計(jì)數(shù)0、0.5、1、2、4 h時(shí)混合液中的Akk活菌數(shù)；在模擬胃液中作用4 h的懸濁液進(jìn)一步以體積比1∶10加至模擬腸液中，在0、0.5、1、2、4 h分別取樣計(jì)活菌數(shù)。每組3個(gè)平行，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。以存活率評(píng)價(jià)Akk分別對(duì)模擬胃腸液的耐受能力。如公式(1)所示：

(1)

式中：Ni為不同時(shí)間點(diǎn)樣品中的活菌數(shù)；N0為初始活菌數(shù)。

膽鹽耐受性：向膽鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1.0%、1.2%、1.4%、1.6%的BHI培養(yǎng)基中分別加入體積分?jǐn)?shù)1.0%的Akk發(fā)酵液，37 ℃下靜置培養(yǎng)，在0、3、6、9、24 h分別取樣進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，并按公式(1)計(jì)算存活率，以菌株存活率來評(píng)價(jià)Akk對(duì)膽鹽的耐受能力。

1.2.3 低聚糖對(duì)Akk生長的影響

以10%的接種量將Akk發(fā)酵液接種到不同濃度的3種低聚糖培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)。分別在0、12、24、36、48、60 h時(shí)間點(diǎn)取樣，在600 nm處測(cè)定OD值。

1.2.4 Akk利用低聚糖產(chǎn)短鏈脂肪酸(short-chain fatty acids，SCFAs)的分析

1.2.4.1 糖耗曲線測(cè)定

采用DNS法測(cè)定Akk在低聚糖培養(yǎng)基不同發(fā)酵時(shí)間樣品的還原糖濃度[11]。取1 mL發(fā)酵樣品與1 mL DNS沸水浴反應(yīng)10 min后，加去離子水9 mL終止反應(yīng)，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，還原糖含量為縱坐標(biāo)，繪制Akk對(duì)不同低聚糖的消耗曲線。

1.2.4.2 SCFAs分析

將Akk在不同低聚糖培養(yǎng)基中的發(fā)酵液樣品12 000 r/min離心5 min，上清液用0.22 μm濾膜過濾，采用HPLC檢測(cè)SCFAs，色譜柱：Waters XBridge C18(5 μm)，流動(dòng)相：30%乙腈、70%水(0.05%磷酸)，柱溫35 ℃，流速0.5 mL/min，進(jìn)樣體積20 μL。

1.2.5 FESEM觀察

Caco-2細(xì)胞在RPMI 1640中連續(xù)培養(yǎng)21 d后，通過離心收集細(xì)胞重懸培養(yǎng)液中，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1.0×107CFU/mL。Akk發(fā)酵液離心收集菌體，PBS緩沖液洗滌3次后配制懸浮液，調(diào)節(jié)菌體濃度為1.0×107CFU/mL。添加至Caco-2細(xì)胞中孵育6 h后，在含3%戊二醛磷酸鹽緩沖液中固定24 h，然后PBS洗滌3次，每次15 min，在60 ℃下96%乙醇脫水6 h，室溫干燥。最后，用金-鈀(約2～4 nm厚)進(jìn)行等離子涂層，并通過FESEM在0.1～30 kV的加速電壓下以納米圖像分辨率進(jìn)行分析。

1.2.6 生物膜的測(cè)定

將Akk接種到不同濃度的低聚糖液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24 h結(jié)束后，將菌濃度調(diào)為1.0×107CFU/mL 置于 96孔板里培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)基，加入0.2 mL 1%結(jié)晶紫作用30 min，用蒸餾水漂洗后加入0.2 mL 95%的乙醇，所得有色溶液在590 nm測(cè)量吸光度，重復(fù)試驗(yàn) 3次并取平均值記為OD值。以Akk在不含低聚糖的培養(yǎng)基中同等波長下的吸光度做為對(duì)照，重復(fù)3次試驗(yàn)并記錄平均值為D。以對(duì)照的平均值加3倍標(biāo)準(zhǔn)差作為生物膜形成的界定值Dc(D+3S)，將OD與Dc進(jìn)行比較，判定細(xì)菌形成生物膜能力：OD≤Dc，無生物膜形成能力；Dc4Dc，強(qiáng)生物膜形成能力[12]。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)分析采用OriginPro 9.1軟件進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，每組3個(gè)平行，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。使用SPSS 23.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，不同組間比較采用單因素方差分析進(jìn)行差異顯著性分析，P<0.05表示差異顯著，用*表示，P<0.01表示差異極顯著，用**表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 Akk對(duì)模擬消化液耐受性評(píng)價(jià)

經(jīng)過消化系統(tǒng)到達(dá)腸道是益生菌發(fā)揮益生作用的基礎(chǔ)。因此，Akk在胃腸液和膽鹽等高滲透壓環(huán)境的耐受能力是評(píng)價(jià)其是否能夠作為益生菌應(yīng)用的重要指標(biāo)之一。從模擬胃液中Akk存活率來看(圖1)，Akk在模擬胃液中0.5 h存活率高達(dá)92.16%，隨后開始下降，在1～2 h間趨于平穩(wěn)；在2～4 h內(nèi)Akk存活率持續(xù)下降，但仍能維持在80%以上。隨后進(jìn)入模擬腸液后，Akk存活率下降幅度平緩，總體處于較穩(wěn)定的水平，存活率接近77%，說明Akk具有耐受模擬胃腸液的能力。

圖1 Akk對(duì)模擬胃腸液的耐受性Fig.1 Tolerance of Akk to simulated gastrointestinal fluids

進(jìn)一步評(píng)價(jià)Akk對(duì)膽鹽的耐受能力。由圖2可知，Akk存活率隨膽鹽處理時(shí)間無明顯差異，膽鹽濃度增加Akk存活率表現(xiàn)小幅度降低，在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.2%膽鹽的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后存活率為83.7%，在1.4%及1.6%膽鹽的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h存活率分別為80.3%和78.1%，說明Akk具有較好的膽鹽耐受性能力。文獻(xiàn)中報(bào)道了該模式菌株與植物乳桿菌Lactobacillusplantarumsubsp.plantarumATCC14917胃腸耐受性的對(duì)比。Akk本身表現(xiàn)出比植物乳桿菌更優(yōu)良的耐受能力，而當(dāng)利用黃原膠和結(jié)冷膠包埋菌體后，植物乳桿菌耐受性更強(qiáng)。Akk良好的耐受能力不僅與包埋介質(zhì)相關(guān)，也與其自有的耐酸系統(tǒng)有關(guān)[13]。

圖2 Akk在含不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)膽鹽培養(yǎng)基中生長情況Fig.2 Growth of Akk in media containing bile salts with different concentrations

2.2 Akk黏附性

腸道微生物對(duì)宿主腸道上皮細(xì)胞的黏附能力是微生物定植腸道并與宿主互作的重要性質(zhì)。以Caco-2細(xì)胞模擬腸上皮細(xì)胞，采用FESEM觀察Akk對(duì)細(xì)胞的黏附。從圖3可直觀觀察到，Akk能較好地附著于分化狀態(tài)的Caco-2細(xì)胞微絨毛尖端上。這與文獻(xiàn)中采用熒光染色觀察的結(jié)果一致。Akk對(duì)不同分化狀態(tài)的Caco-2細(xì)胞均有一定的黏附能力，共培養(yǎng)時(shí)跨上皮電阻顯著提高，增加了腸上皮細(xì)胞的完整性[14]。Akk黏附能力可能與其良好的自聚能力有關(guān)[15]，自聚能力強(qiáng)的益生菌通常具有較強(qiáng)的上皮細(xì)胞黏附能力[16]。

a-Caco-2細(xì)胞;b-Akk與Caco-2細(xì)胞孵育圖3 Akk對(duì)Caco-2細(xì)胞黏附性的FESEM圖Fig.3 FESEM images for adhesion ability of Akk to Caco-2 cells

2.3 Akk對(duì)低聚糖的利用與代謝產(chǎn)SCFAs分析

2.3.1 低聚糖對(duì)Akk生長影響

作為調(diào)節(jié)腸道微生物的益生元，低聚糖具有促進(jìn)益生菌增殖等作用。考查菌株對(duì)低聚糖的利用能力成為評(píng)價(jià)益生菌性能指標(biāo)之一[17]。結(jié)合目前關(guān)于低聚糖類益生元的研究現(xiàn)狀，我們選擇分別具有陰離子、陽離子、中性特征的褐藻寡糖、殼寡糖與甘露寡糖3種低聚糖進(jìn)行評(píng)價(jià)，考查Akk對(duì)其利用與代謝能力，輔助了解Akk與低聚糖益生元的作用。整體分析Akk生物量隨時(shí)間的變化可知，Akk在12 h以內(nèi)均可以快速利用3種低聚糖生長，并在12 h達(dá)到最大；12～60 h，Akk對(duì)褐藻寡糖和殼寡糖的利用基本維持不變(圖4-a、圖4-b)，對(duì)甘露寡糖的利用能力略有增加(圖4-c)。比較不同種類的低聚糖利用情況發(fā)現(xiàn)，3種低聚糖中，以殼寡糖對(duì)Akk生長促進(jìn)作用相對(duì)明顯，1 000 μg/mL的殼寡糖培養(yǎng)基中OD值最高，約0.7。不同低聚糖對(duì)益生菌生長的影響可能與菌株對(duì)糖的利用偏好性有關(guān)[18]。低聚糖的濃度對(duì)Akk的生長情況影響不顯著，3組濃度對(duì)應(yīng)的生長曲線幾乎重合。

a-褐藻寡糖;b-殼寡糖;c-甘露寡糖圖4 Akk在不同低聚糖培養(yǎng)基中生長情況Fig.4 Growth of Akk in media containing various oligosaccharides with different concentrations

2.3.2 Akk對(duì)低聚糖的利用

通過培養(yǎng)基中剩余還原糖的含量測(cè)定考查Akk對(duì)低聚糖的利用情況。圖5可以看出，12 h以內(nèi)還原糖含量迅速降低，說明Akk可快速利用3種低聚糖；12 h后，還原糖的含量基本趨于穩(wěn)定，這與上述Akk在3種低聚糖培養(yǎng)基中的生長曲線一致。比較3種低聚糖的利用情況，Akk對(duì)褐藻寡糖和殼寡糖的利用程度相當(dāng)，略高于甘露寡糖。研究發(fā)現(xiàn)，Akk可表達(dá)多種多糖降解酶，包括β-半乳糖苷酶、α-巖藻糖苷酶、α-唾液酸酶、β-氨基己糖苷酶等，輔助其對(duì)不同結(jié)構(gòu)母乳寡糖的降解利用[19]。除Akk外，其他益生菌對(duì)糖類底物的利用也有報(bào)道。如雙歧桿菌在胃腸道的定植能力很大程度上依賴于對(duì)碳水化合物的利用[20]，且不同菌株對(duì)糖的利用情況不同，如青春雙歧桿菌優(yōu)先利用半乳糖、甘露糖、葡萄糖、低聚果糖和菊粉，而對(duì)N-乙酰半乳糖胺偏好性則較低[21]。Akk菌對(duì)糖利用與代謝的機(jī)制值得進(jìn)一步研究。

圖5 Akk糖耗曲線Fig.5 Consumption curve of reducing sugars for Akk

2.3.3 Akk利用低聚糖產(chǎn)SCFAs

SCFAs是腸道菌利用益生元產(chǎn)生的一類有助于調(diào)節(jié)能量代謝和腸道穩(wěn)態(tài)的代謝物，SCFAs有助于腸道穩(wěn)態(tài)和能量代謝的調(diào)節(jié)，與代謝性疾病[22]、血腦屏障的通透性調(diào)節(jié)[23]、抗病毒免疫有密切的聯(lián)系[24]，乙酸、丙酸和丁酸是主要種類[25]，其中，乙酸產(chǎn)生量最大，可作為腸外周細(xì)胞的能量來源，為機(jī)體生理活動(dòng)提供能量；丙酸可影響肝臟和膽固醇代謝，丁酸是結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞的主要能量來源，均與結(jié)腸健康狀態(tài)密切相關(guān)[26]。圖6結(jié)果顯示，Akk在不添加低聚糖培養(yǎng)基中幾乎不產(chǎn)SCFAs，總酸含量低于10 mg/mL；添加3種低聚糖后SCFAs產(chǎn)量顯著提高，主要集中于乙酸、丁酸、丙酸和戊酸，其中，含量最高的均為乙酸(P<0.01)，約是丙酸含量的50倍，其次是丁酸(P<0.05)，戊酸最少。進(jìn)一步比較發(fā)現(xiàn)，Akk利用3種低聚糖代謝產(chǎn)生的SCFAs比例不盡相同。Akk利用褐藻寡糖產(chǎn)丁酸的能力高于其他2種低聚糖(P<0.05)，而利用殼寡糖產(chǎn)乙酸的能力最強(qiáng)(P<0.01)，質(zhì)量濃度為(51.62±0.23)mg/mL。這一方面可能與不同種類低聚糖的糖基組成及結(jié)構(gòu)有關(guān)[27]，另一方面，與益生元利用相關(guān)的基因往往是誘導(dǎo)表達(dá)，從而會(huì)引起代謝物的不同[28]。研究表明，包括Akk在內(nèi)的腸道益生菌可表達(dá)多種糖苷水解酶以降解聚糖或低聚糖等膳食纖維，進(jìn)而通過多種生物途徑最終產(chǎn)生乙酸、丙酸和丁酸等SCFAs，為宿主代謝提供能量[29]。

圖6 Akk產(chǎn)SCFAs情況Fig.6 Production of SCFAs of Akk注：*表示P<0.05，**表示P<0.01(下同)

2.4 Akk形成生物膜能力分析

微生物為了適應(yīng)所處環(huán)境，通過分泌胞外多糖和凝膠狀黏液使菌體相互黏連進(jìn)而形成生物膜。生物膜的形成是益生菌形成優(yōu)勢(shì)占位、發(fā)揮益生作用的重要途徑。如圖7-a所示，Akk在未添加低聚糖的培養(yǎng)基中有一定的自聚集能力，但未形成明顯的生物膜。低聚糖的添加可顯著促進(jìn)Akk形成生物膜，其中，在添加褐藻寡糖培養(yǎng)基中，Akk周圍包裹致密黏液層，形成較為致密的生物膜(圖7-b)，而在含殼寡糖和甘露寡糖的培養(yǎng)基中，Akk能形成較為明顯的生物膜，但致密與連續(xù)程度不及褐藻寡糖(圖7-c、圖7-d)。

a-Akk組;b-Akk添加褐藻寡糖組;c-Akk添加殼寡糖組;d-Akk添加甘露寡糖組圖7 Akk在不同低聚糖培養(yǎng)基中形成生物膜的FESEM圖Fig.7 FESEM images of biofilm for Akk in media with various oligosaccharides

進(jìn)一步結(jié)合染色結(jié)果進(jìn)行比較。如圖8所示，Akk在有無低聚糖添加的培養(yǎng)基中能形成少量生物膜，成膜能力較弱(圖8-a)。這與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致。文獻(xiàn)中采用結(jié)晶紫染色法測(cè)定Akk和植物乳桿菌生物膜的形成情況，結(jié)果表明，植物乳桿菌具有強(qiáng)生物膜形成能力，而Akk生物膜形成能力較弱[14]。3種低聚糖均可顯著提高Akk的成膜能力至中等，OD590顯著升高(P<0.05)，低聚糖質(zhì)量濃度在0～500 μg/mL時(shí)，生物膜形成能力隨濃度增加而增加；在500～1 000 μg/mL，生物膜形成能力隨低聚糖濃度增加而降低，可能是較高濃度的低聚糖未能發(fā)揮協(xié)同Akk生長的效果，其中以500 μg/mL褐藻寡糖中的Akk生物膜形成效果最好(P<0.01)，OD值為1.996±0.01。因此，低聚糖的添加顯著增加了Akk生物膜的形成能力。

a-Akk在BHI培養(yǎng)基中的生物膜形成能力;b-Akk在低聚糖BHI培養(yǎng)基中的生物膜形成能力圖8 Akk生物膜形成能力Fig.8 The ability of biofilm formation for Akk

3 結(jié)論

本研究以Akk模式菌株ATCC BAA-835為研究對(duì)象，通過體外靜置培養(yǎng)的方式探討了該菌株在胃腸液中的耐受情況，以及對(duì)Caco-2細(xì)胞的黏附性，并且探究了Akk對(duì)3種低聚糖的利用特性以及生物膜形成能力。研究結(jié)果表明，Akk具有較好的耐受胃酸、腸液與膽鹽的特性，能夠黏附在分化的Caco-2細(xì)胞上。培養(yǎng)基中添加3種低聚糖均有利于Akk的快速生長，12 h后進(jìn)入穩(wěn)定期，其中以殼寡糖培養(yǎng)基中Akk生長情況最好，結(jié)果與糖耗曲線相互吻合。Akk利用低聚糖產(chǎn)SCFAs中含量最高的均為乙酸，其次為丁酸，且利用褐藻寡糖產(chǎn)丁酸的能力最高，利用殼寡糖產(chǎn)乙酸的能力最強(qiáng)。Akk自身具有弱生物膜形成能力，低聚糖可顯著提高生物膜形成能力至中等，其中Akk在添加褐藻寡糖培養(yǎng)基中生物膜形成能力較好，可以看出低聚糖促進(jìn)了Akk生物膜的形成。這些結(jié)果表明，本研究利用體外評(píng)價(jià)手段，從微生物性能角度探討了Akk腸道益生作用的潛在機(jī)制，豐富了對(duì)Akk作為腸道益生菌的認(rèn)知。