基于CRISPR/Cas9系統對乳酸乳球菌進行綠色熒光蛋白標記

宋馨，王慧，袁世豪，黃佳偉，易文濤，艾連中

(上海理工大學 醫療器械與食品學院，上海食品微生物工程研究中心，上海，200093)

乳酸乳球菌(Lactoccuslactis)是一種公認的益生菌，被應用于發酵乳制品中的歷史已達數千年。在食品工業中，乳酸乳球菌作為復合發酵劑的重要組成部分，主要應用于葡萄酒、乳酪及腌制食品中[1-3]。另一方面，乳酸乳球菌作為乳酸菌的代表菌株，其基因組規模相對較小[4]，較乳桿菌容易操作，在基因工程及代謝方面也已經作為理想的模型菌株、微生物細胞工廠[5]。由于乳酸乳球菌不含內毒素，現已成為枯草芽孢桿菌及大腸桿菌等更安全的替代菌種[6]，并逐漸成為實驗室用來異源蛋白表達和各種類型生理研究的主力軍[7]。近年來，益生菌被開發用作口服疫苗載體，乳酸乳球菌具有良好的免疫調節特性、公認的安全性、在腸道內極少定植并且是異源蛋白生產的有效細胞工廠[8-9]，因此被選作體內運送載體，用以輸送治療劑(如細胞因子)。因此，研究乳酸乳球菌在體內的運送情況具有重要意義。但目前對乳酸菌的運送研究大多通過體外模擬實驗和細胞實驗，無法真實反映體內情況[10-13]。要研究乳酸乳球菌在體內的運送，需要對其進行標記。增強型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein，eGFP)具有穩定遺傳，靈敏度高，對細胞無毒害等特點，并能利用不同啟動子調節其表達量，更適合用作乳酸乳球菌體內研究的報告基因[14]。大多數研究通常采用質粒對其進行宿主中的過表達[15-16]，但是這種方法穩定性低，且必須引入抗性篩選標記，而將eGFP基因整合到基因組中，可成功避免此缺點。

乳酸乳球菌中已開發多種表達蛋白的工具，但大多應用起來耗時耗力。隨著生物技術的不斷完善，第三代人工核酸酶(CRISPR-Cas9)被深入研究，人們在不同生物體內陸續構建成功基于CRISPR-Cas的高效基因編輯工具，使研究人員能夠對特定的基因或基因組上的特定位點進行精確的靶向修飾，該工具目前已在乳酸菌中得到廣泛應用[17]。本實驗室已成功構建了適用于乳酸乳球菌，基于CRISPR-Cas9的單質?；蚓庉嫻ぞ?，能夠對乳酸乳球菌進行無痕基因編輯[18]。

本研究基于實驗室已有的乳酸乳球菌基因編輯質粒pLL25，替換目標基因的sgRNA及同源臂，構建重組質粒pYSH，利用CRISPR-Cas9編輯技術，將eGFP基因插入L.lactisNZ9000基因組中，使L.lactis被綠色熒光標記，為L.lactis在體內運送或其他功能的深入研究提供可能。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 菌株、質粒及引物

表1和表2列出本研究所用菌株、質粒及引物。Snapgene 4.1.9設計引物，華大基因(上海)股份有限公司合成。

表1 菌株和質粒Table 1 Strains and plasmids

表2 引物序列Table 2 Primer sequences

1.1.2 菌株及培養條件

大腸桿菌DH5α為克隆宿主，培養基為LB(luria-bertani)，所有含有基因編輯質粒的大腸桿菌生長于LB-Kan(卡那霉素質量濃度為50 μg/mL)培養基上，培養溫度為30 ℃。GM17培養基用于乳酸乳球菌的培養，配方為(g/L)：胰蛋白胨5、大豆蛋白胨5、牛肉膏5、酵母浸出粉2.5、β-磷酸甘油二鈉19、MgSO4·7H2O 0.25、葡萄糖5、瓊脂粉(Agar)15(液體培養時不添加)，必要時，添加紅霉素作為篩選標記，工作質量濃度為10 μg/mL。乳酸乳球菌復蘇培養基：GM17，CaCl22 mmol/L,MgCl220 mmol/L。

乳酸乳球菌感受態洗滌緩沖液Ⅰ：體積分數為10%的甘油、0.5 mol/L 蔗糖；洗滌緩沖液Ⅱ：體積分數為10%的甘油、0.5 mol/L蔗糖和0.05 mol/L EDTA；洗滌緩沖液Ⅲ：100 mmol/L 乙酸鋰二水、10 mmol/L 二硫蘇糖醇(dithiothreitol，DTT)、0.6 mol/L 蔗糖、1 mol/L Tris-HCl(pH 7.5)[19]。

1.1.3 酶及試劑盒

PremixTaqTM酶、DNA限制性內切酶，大連寶生物公司；KOD-plus-neo DNA聚合酶或KOD FX聚合酶，用于PCR擴增及菌落PCR分析，東洋紡生物科技有限公司；無縫克隆試劑盒(ClonExpress Ⅱ One Step Cloning Kit)，用于DNA組裝及質?？寺。钅z回收試劑盒(AxyPrepTM DNA Gel Extraction Kit)、質粒小量提取試劑盒(AxyPrepTMPlasmid Miniprep Kit)，用于DNA 操作，南京諾唯贊生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1E.coliTop10感受態細胞制備

-80 ℃凍存的E.coliTop10劃線活化，單菌落接種于4 mL LB液體培養基中，37 ℃、200 r/min搖床培養過夜。種子液以1%的接種量轉接至50 mL LB液體中(置于250 mL錐形瓶中)，37 ℃、200 r/min搖床培養至OD600=0.3～0.5，冰上靜置10 min。離心收集菌體，用預冷的0.1 mol/L CaCl2溶液洗滌細胞2次。預冷的含有0.1 mol/L CaCl2的15%甘油溶液重懸細胞。分裝，-80 ℃凍藏備用。以上所有離心條件均為4 ℃，4 500 r/min，10 min。

1.2.2 重組質粒pYSH構建

以質粒pLL25為模板，HA1-F、HA1-R、HA2-gRNA-F、HA2-gRNA-R為引物，分別PCR擴增獲得上下游同源臂HA-1、HA-2；以pIB184-eGFP為模板，P23E-F、P23E-R為引物，擴增獲得插入片段P23-eGFP。PCR反應條件參考說明書。割膠回收上下游同源臂HA-1、HA-2及插入片段P23-eGFP，按摩爾數比為1∶1∶1混合后為模板，以HA1-F/HA2-gRNA-R為引物，overlap 獲得片段HA-1+P23+eGFP+HA-2，割膠回收。ApaI和XbaI雙酶切質粒pLL25骨架，割膠回收獲得線性化載體。將線性化載體骨架與目的片段HA-1+P23+eGFP+HA-2經ClonExpress Ⅱ One Step Cloning Kit無縫克隆連接，構建獲得重組質粒pYSH(構建過程如圖1所示)。PCR驗證引物為TY-F/R。

1.2.3L.lactisNZ9000感受態制備方法

劃線活化L.lactisNZ9000，挑取單菌落，接種于GM17液體培養基中，30 ℃靜置培養活化2代。以8%的接種量轉接至含有0.5 mol/L蔗糖和8 g/L甘氨酸的GM17液體培養基中，30 ℃靜置培養至吸光值OD600≈0.2，離心收集菌體，棄去上清液，溶液Ⅲ重懸細胞，室溫靜置30 min，離心收集菌體，棄去上清液，溶液Ⅰ、Ⅱ分別洗滌細胞，最后重懸于溶液I中。每100 μL感受態細胞分裝于預冷的離心管中，-80 ℃凍藏備用。以上所有離心條件為4 ℃，6 000 r/min，15 min[19]。

圖1 pYSH質粒構建示意圖Fig.1 Schematic diagram of plasmid pYSH construction

1.2.4L.lactisNZ9000熒光標記

將構建成功的重組質粒pYSH電轉至L.lactisNZ9000感受態細胞中，方法如下：取出-80 ℃冰箱凍存的L.lactisNZ9000感受態細胞，冰上解凍；向感受態細胞中加入0.1 μg pYSH質粒并吹打混勻，冰上靜置5 min；預冷2 mm電轉杯，將混合有質粒的感受態細胞轉移至其中，輕輕敲打，使其落于電轉杯底部，電擊，隨后迅速加入900 μL 30 ℃溫育的復蘇培養基，混勻后轉至離心管中，30 ℃ 復蘇培養2 h；將復蘇液涂布于GM17-Em固體平板，30 ℃靜置培養24～36 h，挑取轉化子，菌落PCR驗證，驗證引物為YZ-F/R，L.lactisNZ9000野生型為對照。對PCR產物送測。將測序正確的菌株命名為L.lactisNZ9000Δldh:eGFP。

1.2.5L.lactisNZ9000Δldh:eGFP熒光強度的測定

將野生型L.lactisNZ9000和突變型L.lactisNZ9000Δldh:eGFP菌株劃線活化，30 ℃靜置培養24～36 h，獲得單菌落，挑取單菌落分別轉接至GM17無抗及含抗的液體培養基。30 ℃靜置培養，分別在對數期前期、對數后期、穩定期收集1.5 mL菌液，條件為12 000 r/min、離心1 min；20 mmol/L Tris-HCl(pH 7.4)溶液洗滌菌體2次，重懸，混勻后加入96孔板(每個樣品取100 μL)。在激發波長480、發射波長525下，用酶標儀測量其eGFP的表達強度及OD600。每個樣品3個平行[20]。使用GraphPad Prism 8.4.0繪圖，并對數據進行單因素方差分析(ANOVA)，比較不同時期突變型菌株與野生型菌株熒光強度的差異，認為P<0.05有統計學差異(***P<0.001，****P<0.000 1)。

2 結果與分析

2.1 重組質粒pYSH構建

目的片段HA-1、P23+eGFP、HA-2大小分別為1 044、955、1 150 bp，PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳分析，結果如圖2所示，大小與目的條帶一致，說明擴增成功。

M:DL 5 000 DNA markera- PCR擴增HA-1;b-PCR擴增P23+eGFP;c-PCR擴增HA-2圖2 PCR擴增HA-1、P23+eGFP、HA-2Fig.2 PCR amplified the fragment HA-1、P23+eGFP and HA-2

目的片段HA-1+P23+eGFP+HA-2大小為3 016 bp，PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳分析，結果如圖3所示，大小與目的條帶一致，說明overlap擴增成功。

a-PCR擴增HA-1+P23+eGFP+HA-2(M-DL 5 000 DNA marker);b-Apa I/Xba I酶切pLL25(M-DL 15 000 DNA marker)圖3 PCR擴增HA-1+P23+eGFP+HA-2及雙酶切載體pLL25Fig.3 PCR amplified the fragment HA-1+P23+eGFP+HA-2 and double enzyme digested the vector pLL25

ApaI和XbaI雙酶切質粒pLL25，可獲得1 547、564、12 136 bp的線性化DNA片段，酶切產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，結果見圖3，所得條帶與理論條帶一致，說明酶切正確，可用于后續實驗?；厥沾笮?2 136 bp的條帶作為載體片段，再與目的片段HA-1+P23+eGFP+HA-2連接，利用E.coliTop 10感受態細胞對連接產物進行轉化克隆中，卡那霉素為篩選標記，30 ℃靜置培養至長出單菌落，對其進行菌落PCR驗證，驗證引物為TY-F/R。獲得陽性轉化子，并對其進行測序鑒定。將測序結果與目的序列進行比較，序列完全一致，說明質粒pYSH構建成功，可用于乳酸乳球菌基因組的編輯。

2.2 L.lactis NZ9000熒光標記

將構建成功的基因編輯質粒pYSH電轉入L.lactisNZ9000感受態細胞中，涂布到帶有紅霉素的篩選平板上，30 ℃培養24～36 h，挑取轉化子進行菌落PCR驗證，驗證結果如圖4所示。

M-DL 5 000 DNA marker;1～12-轉化子PCR驗證;13～14-pLL25;15～16-L.lactis NZ9000圖4 PCR驗證轉化子Fig.4 PCR verified transformants

將驗證有正確條帶的陽性轉化子挑取到GM17含紅霉素液體培養基中，傳代培養3代，取菌液為模板，用引物Cldh-HA-YZ-F/R進行PCR驗證，PCR產物送測。測序結果顯示eGFP成功插入L.lactisNZ9000基因組，獲得L.lactisNZ9000Δldh:eGFP突變株。

2.3 L.lactis NZ9000Δldh:eGFP熒光強度的測定

以野生型L.lactisNZ9000為對照，測量不同時期突變菌株L.lactisNZ9000Δldh:eGFP的熒光強度(圖5)。結果表明，不同生長時期，突變型菌株的熒光強度與野生型均有極顯著性差異。

圖5 不同生長時期熒光表達情況Fig.5 Fluorescence expression in different growth stages注：***表示P<0.001,****表示P<0.000 1

3 結論與討論

食品級乳酸菌(lactic acid bacteria，LAB)是開發口服載體的良好候選菌，也是黏膜輸送策略中減毒病原體的有吸引力的替代品。其中，乳酸乳球菌不產生內毒素，并且在腸道內極少定植，是一種良好的疫苗及治療劑等運送載體，具有極大的應用前景。目前，越來越多的研究聚焦于乳酸乳球菌的體內運送情況，但大部分研究都是通過體外模擬或細胞實驗進行的，與體內真實運送情況存在一定差異。對乳酸乳球菌進行標記，可以幫助研究其在體內的實際運送情況。在乳酸菌中，近幾年常用的標記方法為熒光素類探針標記法，該方法易被樣品背景干擾，并且熒光素極易在強光下分解，對pH敏感[21]，因此亟需一種更加穩定高效的基因組標記方法。乳酸乳球菌中應用最多的基因插入法是基于質粒的同源重組法，但該方法耗時久、效率低，且重組效率依賴于宿主細胞的電轉效率和自身重組酶。本研究利用已構建的CRISPR/Cas9單質?；蚓庉嬒到y將eGFP基因插入L.lactisNZ9000基因組中，利用綠色熒光蛋白標記L.lactisNZ9000，成功獲得標記突變株。該突變株性能穩定，無需添加抗性篩選標記，實時定量PCR測定熒光強度，結果表明該突變株中的綠色熒光蛋白在宿主不同生長階段均能穩定表達熒光，且能隨宿主的繁殖穩定遺傳，相比傳統方法節約前處理時間，省時省力，為進一步深入研究乳酸乳球菌在體內的運送情況提供良好的載體。