牛皮膠原蛋白在牛肉餅中的抗凍特性評價

徐毓謙，郭美，劉貴珊，袁江濤，郭佳俊

(寧夏大學 食品與葡萄酒學院，寧夏 銀川，750021)

隨著我國人民生活水平的提高，調理肉制品正逐漸成為我國肉類消費的主流[1-2]。調理肉制品在貯藏過程中所含水分和肌原纖維蛋白質會不斷流失[2-3]，失去肉制品原本的彈性和保水能力，導致蛋白質的冷凍變性[3]。如何在冷凍過程中保證肉制品的營養價值，是亟待解決的難題[4]。目前，在冷凍肉品中加入抗凍保護劑是抑制肉制品蛋白質冷凍變性的方法之一。一般情況下，抗凍保護劑可以有效溶解冰晶，阻斷冰晶生長，防止肌原纖維蛋白功能和結構的改變，減少產品品質劣變，提高食品貯藏品質[5]。

目前，國內外對于抗凍保護劑的研究大多停留在定性描述的能力分析，且處于傳統抗凍保護劑的應用階段，對于新型蛋白質水解物抗凍保護劑研究尚未進行深入研究。本文針對調理牛肉餅在冷凍期間的變化進行深入研究，測定其水分和肌原纖維蛋白等含量變化，探究抗凍劑牛皮膠原蛋白對調理牛肉餅中水分和肌原纖維蛋白質的保護能力，為調理牛肉餅冷凍期間品質評價提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

選取牛后腿肉作為主要原料，采用保鮮膜包裝，4 ℃ 保存。

牛皮膠原蛋白，西安卓瑞生物科技有限公司；Tris-maleate，雷根生物；氯化鉀、氯化鈣，天津市大茂化學試劑廠；ATP粉劑、偏鉬酸銨，上海山浦化工有限公司；高氯酸，煙臺市雙雙化工有限公司；鉬酸銨，徐州天鴻化工有限公司；雙縮脲法試劑盒，南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設備

BSA224S-CW電子天平，賽多利斯科學儀器(北京)有限公司；HH-4數顯恒溫水浴鍋、JI-1精密增力電動攪拌器、國華電器有限公司；752 N紫外可見分光光度計，上海儀電分析儀器有限公司；TGL-16M高速冷凍離心機，上海盧相儀離心機儀器有限公司；Testo 205型便攜式pH計，德國德圖(深圳)有限公司；WSC-S色差儀，北京精密科學儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 原料預處理

先使用4～10 ℃的清水漂洗原料肉2次，每次2 min。將肉切割成1 cm3的肉塊，去除表面的血絲等。于-24 ℃的冰箱中進行凍藏，保證肉品中心溫度迅速凍結到-18 ℃。

1.3.2 測定條件

分別測定在-24 ℃凍藏7 d和30 d牛肉餅的指標變化。另外測定牛肉餅在凍融循環2、4、6次條件下的指標變化(-24 ℃凍藏24 h，4 ℃解凍6 h記1次循環)，設置空白對照組，即4 ℃下新鮮肉。

1.3.3 牛肉餅加工工藝

采用孟子晴等[9]的制作方法，略有修改。按工藝要求修整肉塊，去除表面的脂肪、筋腱、軟骨以及結締組織，手動攪碎制成肉糜，以1個牛肉餅的肉重記為 1，以噴灑的方式加入2%、4%、6%、8%(質量份數)的牛皮膠原蛋白，2%(質量份數)食鹽、0.3%(質量份數)復合磷酸鹽，攪拌均勻后4 ℃冷藏成型為直徑 6 cm，厚1 cm，內無氣泡的肉餅，生牛肉糜餅速凍后貯存于-24 ℃冰箱。生牛肉指標于4 ℃解凍5 h，待測。

1.3.4 解凍損失率的測定

取樣品30 g，使用濾紙擦干表面殘留的水分，每個處理組至少重復測定3次[10]，解凍損失率計算如公式(1)所示：

(1)

1.3.5 pH的測定

選用樣品，利用Testo 205型便攜式pH計，測定樣品在冷凍期內pH值的變化情況，且每個處理組至少重復測定3次。

1.3.6 色澤的測定

利用CM-2300 d型分光測色計，測定樣品在冷凍期內表面顏色參數的變化情況。為保證測定結果準確，樣品測定前需對分光測色計進行白板校正和零校正。樣品測定時，在樣品表面選擇3處不同地方進行測定，并記錄L*(亮度值)、a*(紅度值)和b*(黃度值)的示數，最終分別計算每組顏色參數的平均值和標準差。每個處理組至少重復測定3次。

1.3.7 鹽溶性蛋白溶解量的測定

參考宋蕾[10]的測定方法，使用雙縮脲試劑盒的說明書進行。

1.3.8 鹽溶性蛋白凝膠保水性測定

參考趙子瑞[11]的測定方法，將50 mg/mL的肌原纖維蛋白溶液放入10 mL的離心管中，以1 min上升1 ℃ 的加熱速率從20 ℃水浴加熱到75 ℃，并在75 ℃保持30 min后用流水立即冷卻，放入4 ℃冰箱12 h。使用離心法測定凝膠保水性。準確稱取3 g凝膠至5 mL 的離心管中，10 000 r/min 4 ℃離心10 min，棄去上清液。分別記錄離心前后離心管和凝膠的總重。凝膠保水性是指離心后總重占離心前總重的百分比(質量分數)。

1.3.9 Ca2+-腺苷三磷酸酶(adenosine triphosphatase，ATPase)活力測定

參考梁鵬等[12]的方法，略作修改，稱取樣品20 g，加入0.6 mol/L NaCl溶液80 mL，在4 ℃ 8 000 r/min高速勻漿30 min后在4 ℃條件下靜置24 h；使用雙層紗布過濾，粗濾液經4 000 r/min離心5 min后，所得上清液即為肌原纖維蛋白溶液。肌原纖維蛋白溶液制備出后，在試管中加入0.5 mL 0.5 mol/L Tris-馬來酸、0.5 mL 0.1 mol/L CaCl2、2.2 mL 2.0 mol/L KCl、0.5 mL 20 mmol/L ATP(pH 7.0)、1.0 mL肌原纖維蛋白溶液和5.3 mL蒸餾水。反應混合液在25 ℃恒溫中水浴，加入酶液后反應開始，反應5 min后加入5 mL 15%(體積分數)高氯酸終止反應。空白組為先加入5 mL 15%高氯酸，再加入其他溶液。采用釩鉬黃比色法測定反應中釋放的無機磷含量，同時設空白對照。Ca2+-ATPase的活性以1 mg蛋白質在1 min內生成的微摩爾Pi來表示。

1.4 數據統計

采用 Design Expert 8.0.6、Origin 2017 和 SPSS 21對試驗數據進行處理。

2 結果與分析

2.1 牛皮膠原蛋白添加量對解凍損失率的影響

解凍損失率是肉制品品質評價的重要指標，影響著肉制品表面微生物群的活化和增殖，降低酶的活性，對肉制品的品質測定產生負面影響[2，13]。由圖1可知，新鮮牛肉的解凍損失率為10.09%；在固定溫度的冷凍貯藏下，解凍損失率隨著時間的延長而增大，這與錢書意等[14]的研究結果相符，導致這一現象的主要原因是由于在貯藏過程中，冷凍牛肉餅中自由水形成冰晶，在解凍時冰晶所化的水沒有充分的時間重新被肌肉組織吸收，導致水分流失；在凍融循環的過程中，隨著循環次數的增多，解凍損失率不斷增大，且解凍損失率更高，這是由于凍融循環過程中，樣品中水分冷凍形成冰晶體，解凍后冰晶體被破壞，導致肌肉發生不可逆機械損傷，水分流失嚴重[15]，這與蒙健宗等[16]和ZHANG等[17]的研究結果相吻合。在相同的貯藏時間內，加入不同含量的牛皮膠原蛋白后，發現在6%的添加量下解凍損失率最低，且顯著低于其他含量(P<0.05)，最高可提高15.74%，這可能由于牛皮膠原蛋白作為一種蛋白質水解物，可以應用滯后效應，降低冰點且改變冰晶形態，從而抑制冰晶生長[15-17]。以上結果表明，牛皮膠原蛋白可以修飾冰晶降低其冰點，通過將大冰晶減少為小冰晶，抑制了在凍融循環下的重結晶。

圖1 牛皮膠原蛋白添加量對不同貯藏條件下解凍損失率的影響Fig.1 Effect of different amount of bovine collagen on thawing loss rate in different storage condition注：圖中同一組中不同小寫字母代表差異顯著(P<0.05)(下同)

2.2 牛皮膠原蛋白添加量對pH值和色澤的的影響

肉制品pH的高低可以反映肉制品品質的好壞[18-19]。新鮮肉品的初始pH值為6.20，由表1可知，隨著貯藏時間的延長，pH不斷降低，可能是由于肌肉中糖類發酵分解產生的乳酸和ATP產生的磷酸不斷增加，導致pH的降低[19]；在凍融循環過程中，pH值隨著凍融循環的次數增加而降低，且降低速度相較于短期和長期貯藏更快(P<0.05)，并在循環6次時最低。這可能是由于低溫冷凍抑制了牛肉餅表面微生物的生長和酶的活性，生成的堿性物質較少，pH未升高[19]。加入不同含量牛皮膠原蛋后實驗組中肉制品的pH與對照組相比變化不顯著，這可能是由于牛皮膠原蛋白對酸性物質沒有抑制作用，且對堿性物質無促進生長的作用，導致pH不受其影響。

表1 冷凍牛肉餅pH和色澤參數比較Table 1 Comparison of pH and color parameters of frozen beef cakes

肉制品的顏色是消費者購買產品時考慮的重要因素之一，也是評價凍藏肉制品的重要指標[20]。由表1可知，在7 d和30 d的貯藏期中，L*值和b*值增大但變化不顯著，a*值減小且變化顯著(P<0.05)，這可能是由于在低溫冷凍過程中，低溫降低了氧合肌紅蛋白的氧化速率，暗褐色的高鐵肌紅蛋白的生成過程受到抑制，使肉制品呈現較好的肉色；在凍融循環過程中，L*值先增大后減小，a*值逐漸減小，在凍融6次時顯著減少(P<0.05)，b*值逐漸增大，在凍融6次時顯著增大(P<0.05)，這與李金平等[21]研究結果相吻合，這可能是由于凍融循環條件下牛肉餅的汁液損失增大，導致前期的L*值不斷增大，色澤相對于初始更鮮亮，但在凍融循環后期，牛肉表面的肌紅蛋白被氧化，形成褐色的高鐵肌紅蛋白，導致色澤變暗，這與QI等[22]的結果相符。而加入不同含量牛皮膠原蛋白后產生了部分變化，但變化不顯著，出現這種情況的原因可能是牛皮膠原蛋白對肉中呈色的肌紅蛋白和高鐵肌紅蛋白無影響，導致肉色變化不顯著。

2.3 牛皮膠原蛋白添加量對鹽溶性蛋白溶解量的影響

鹽溶性蛋白是主要的肌肉蛋白質[23-24]，顯著影響著蛋白質的功能特性，其變性會導致肉制品的劣變。由圖2可知，鹽溶性蛋白溶解量隨著時間的延長而逐漸降低，經顯著性分析可知，在短期、長期和凍融循環下鹽溶性蛋白溶解量下降程度均顯著低于新鮮肉，這是由于在凍藏過程中，蛋白質結構發生改變，其分子間的氫鍵和疏水鍵導致蛋白質表面疏水性增加，蛋白質無法充分吸附水分從而增加了鹽溶性蛋白不穩定性[24]，在凍融循環狀態下，鹽溶性蛋白下降顯著(P<0.05)。這可能是由于在循環解凍過程中，水不斷生成冰晶擠壓蛋白質，使蛋白質的二級結構發生改變，導致肉制品的可溶性蛋白含量減少，食用品質降低，這與LEE等[24]研究結果相符。LEYGONIE等[25]發現冷凍過程中冰晶的形成和生長破壞了肉的微觀結構，且蛋白結構周圍的溶質濃度增大，導致蛋白變性，引起肉制品的劣變。這與本試驗的結果相吻合。在加入不同含量的牛皮膠原蛋白后，各組的蛋白質含量均有顯著提升，對比新鮮肉，鹽溶性蛋白含量隨著牛皮膠原蛋白添加量的提高而上升，且在6%的添加量下蛋白質含量維持得最好，最高可提高25.79%。相對于短期和長期凍藏，蛋白質含量在凍融循環中上升較快。說明牛皮膠原蛋白可以有效地延緩了鹽溶性蛋白溶解量下降的問題，一方面可能是通過增強其蛋白質和水之間的結合，減少蛋白質間的不可逆結合，這與下一節的結果相呼應，另一方面，牛皮膠原蛋白作為大分子化合物，加入后可以提高非凍結相的含量及濃度，自由水等凍結相濃度相對降低，且維持蛋白質分子的水合環境穩定，減緩蛋白質的結構作用力的平衡被破壞的現象。在加入牛皮膠原蛋白時，發現其可以和肉糜均勻混合在一起，呈透明態，具有一定黏性，猜測可以在混合狀態時在肉糜間形成隔膜類的屏障，阻礙各相間的反應，從而減緩鹽溶性蛋白溶解量在低溫和溫度波動狀態下的下降情況。

圖2 牛皮膠原蛋白添加量對不同貯藏條件下鹽溶性蛋白溶解量的影響Fig.2 Effect of different amount of bovine collagen on salt soluble protein content in different storage condition

2.4 牛皮膠原蛋白添加量對鹽溶性蛋白凝膠保水性的影響

肉制品蛋白凝膠保水性與鹽溶性蛋白質含量呈正相關，鹽溶性蛋白的損失越少，其蛋白質的持水能力越高[26]。由圖3可知，在凍藏過程中，鹽溶性蛋白的凝膠保水力隨著時間的延長而下降，在凍融循環過程中，隨著溫度波動次數的增加，其保水力下降速度顯著高于固定溫度凍藏，這說明溫度波動對鹽溶性蛋白凝膠保水性的能力影響較為顯著[27](P<0.05)。這可能是由于在熱凝膠過程中，鹽溶性蛋白加熱后結構變松散，其分子間的網狀結構封鎖了自由水的流動，從而形成較為具有彈性的凝膠產物，而鹽溶性蛋白含量的下降，導致其形成凝膠的能力下降，保水能力降低，這與LIU等[28]和歐陽杰等[26]研究結果相符合，也與本試驗前部分對于鹽溶性蛋白含量的變化趨勢研究相符。與空白對照對比，加入不同含量的牛皮膠原蛋白后的牛肉餅的凝膠保水性有所上升，且在6%時最高，最高可達到34.95%，后續趨于平緩(P>0.05)，這說明在凍藏過程中，牛皮膠原蛋白可以有效地保護蛋白質的冷凍變性，從而減少鹽溶性蛋白的凝膠保水性的降低[28]。

圖3 牛皮膠原蛋白添加量對不同貯藏條件下鹽溶性蛋白凝膠保水性的影響Fig.3 Effect of different amount of bovine collagen on salt-extractable protein water holding capacity in different storage condition

2.5 牛皮膠原蛋白添加量對Ca2+-ATPase活性的影響

由于肌球蛋白的結構在凍藏中發生變性，其位于頭部的Ca2+-ATPase的活性會發生顯著下降，所以Ca2+-ATPase是評價肌動球蛋白分子完整性的良好指標[14]。在肌肉中，Ca2+-ATPase的活性越高，蛋白質變性程度越小[29]。由圖4可知，冷凍后的牛肉餅的Ca2+-ATPase對比于新鮮肉組顯著下降(P<0.05)，且在凍融循環過程中下降更快，這可能是因為在冷凍和溫度波動條件下，蛋白質結不斷發生改變，冷凍變性后蛋白質的Ca2+-ATPase活力減弱[29-30]。在加入不同含量的牛皮膠原蛋白后，Ca2+-ATPase的活力明顯提升，這說明牛皮膠原蛋白對蛋白質產生了明顯的保護作用；在6%添加量時Ca2+-ATPase的活力值最高，后續趨于平穩(P>0.05)，說明此時的蛋白質性質最穩定，蛋白質變性程度最小，Ca2+-ATPase活性增高，最高可上升25.71%。說明牛皮膠原蛋白對Ca2+-ATPase的活性降低有顯著的效果，這與本試驗前部分對于鹽溶性蛋白含量的變化趨勢研究相符。

圖4 牛皮膠原蛋白添加量對不同貯藏條件下Ca2+-ATPase活性的影響Fig.4 Effect of different amount of bovine collagen on Ca2+-ATPase activity in different storage condition

2.6 相關性分析

試驗針對6%牛皮膠原蛋白添加量下，凍藏和凍融循環下牛肉餅的解凍損失率(thawing loss rate, Tlr)、pH、色澤(L*,a*,b*)、鹽溶性蛋白溶解量(salt soluble protein content, SSPC)、鹽溶性蛋白凝膠保水性(salt-extractable protein water holding capacity, SepWHC)以及Ca2+-ATPase活力進行相關性分析,結果如表2所示。解凍損失率與b*值(r=0.848，P<0.01)呈極顯著正相關，與a*值(r=-0.783，P<0.01)和pH值(r=-0.862，P<0.01)、SSPC(r=-0.913，P<0.01)、SepWHC(r=-0.885，P<0.01)和Ca2+-ATPase(r=-0.885，P<0.01)呈極顯著負相關[18]；pH值與a*值(r=-0.808，P<0.01)、SSPC(r=0.597，P<0.01)、SepWHC(r=0.546，P<0.01)、Ca2+-ATPase(r=0.864，P<0.01)呈極顯著正相關[29]，與L*值(r=-0.467，P<0.01)、b*值(r=-0.858，P<0.01)呈極顯著負相關；SSPC與SepWHC(r=0.947，P<0.01)呈極顯著正相關[14]。這說明了牛肉在凍藏過程中，水分的流失導致肌原纖維蛋白出現變性，引起SepWHC、Ca2+-ATPase活力的下降，使其在凍藏過程中品質發生劣變。

表2 冷凍牛肉餅品質指標相關性分析Table 2 Correlation analysis of quality indexes of frozen beef cakes

3 結論

本文研究了不同添加量的牛皮膠原蛋白在凍藏條件下和凍融循環條件下的牛肉餅相關指標的變化規律，發現牛皮膠原蛋白可以有效地抑制肉制品中解凍損失率和汁液損失率的上升，減緩蛋白質的冷凍變性，提高其凝膠保水能力和Ca2+-ATPase的活力，且6%添加量的牛肉制品相對于其他添加量對肉制品的品質保持更加顯著。研究結果表明，牛皮膠原蛋白作為一種綠色高效的抗凍保護劑，對調理牛肉制品中水分和蛋白質有良好的保護能力。本研究為牛皮膠原蛋白作為抗凍劑在冷凍調理牛肉制中的應用提供了一定數據基礎和技術支持。