貯存時間對中高溫大曲質量的影響

陶敏，明紅梅，馬世源，杜向軍，符長彪

(四川輕化工大學 生物工程學院，四川 宜賓，644000)

白酒釀造工藝是我國古代勞動人民智慧的結晶，有著悠久的歷史[1]。俗話說“曲乃酒之骨”，這充分說明了曲在白酒中的重要作用[2-3]。大曲是以單一小麥或小麥、大麥和豌豆混合物為原料，經過粉碎，加水拌料，壓制成磚狀曲塊后，人工控制在一定的溫度、濕度下培育而成的[4]。大曲在用于釀酒前，需要經過一段時間的貯存，可以純化菌種，利于控制較低溫度的緩慢發酵過程，從而提高白酒的品質[5-6]。

張良等[7]研究發現中高溫大曲的糖化力、發酵力在貯存3～6個月變化很小，結合微生物數量的變化，得出曲藥貯存4個月使用效果最好。劉雪等[8]研究得出中高溫大曲中的各類微生物指標和理化指標在貯存3個月后趨于平穩，且隨貯存期延長，細菌等產酸菌逐漸減少，芽孢桿菌等有益微生物增加，建議大曲最短要貯存3個月才可投入生產使用。施思等[9]研究發現中高溫大曲在貯存5個月期間，真菌群落結構不斷調整，大曲發酵力緩慢升高，而糖化力總體為降低的趨勢。一些研究者也對貯存期大曲的風味成分進行了研究。如邢鋼等[10]利用頂空固相微萃取結合氣相色譜-質譜聯用技術(headspace-solid phase micro extraction-GC-MS，HS-SPME-GC-MS)對中高溫大曲貯存過程中揮發性風味成分進行了研究，發現大多數風味物質含量在大曲貯存5～20 d期間整體呈減少趨勢，且到貯存15 d時含量趨于穩定。目前研究者對貯存過程中高溫大曲的理化生化指標和微生物變化規律的研究較多，但針對貯存時間對中高溫大曲風味物質影響的研究較少，且大曲的最佳貯存時間也尚未定論。因此，探索中高溫大曲的最佳貯存時間，以利于更科學地指導大曲生產，成為釀酒企業亟待解決的問題。

本文以秋季安曲的中高溫成品大曲為研究對象，對其貯存過程中理化生化指標值、感官評分及風味物質種類和含量進行分析，探究貯存時間對大曲質量的影響，進一步為確定大曲較佳貯存時間和大曲的生產及使用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗樣品：中高溫成品大曲，四川某白酒生產企業。

實驗試劑：甲醛、己酸、葡萄糖、無水乙醇、碘、次甲基藍、酒石酸鉀鈉，均為分析純，成都市科龍化工試劑廠。

1.2 儀器與設備

DHG-9013A型電熱干燥箱，上海善志儀器設備有限公司；AR224CN型分析天平，上海天平儀器公司；PHS-3C型酸度計，上海儀電科學儀器股份有限公司；LS-50HJ型立式壓力蒸汽滅菌鍋，蘇州奧普實驗室設備有限公司；SW-CJ-1FD超凈工作臺，上海右一儀器有限公司；固相微萃取頭(2 cm 50/30 μm DVB/CAR/PDMS)，美國Supelco公司；Agligent 6890N-5975B型氣相色譜-質譜聯用儀，美國安捷倫公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 取樣方法

以發酵30 d、貯存60 d的中高溫成品大曲為取樣對象。合格成品曲出庫時間(即從安曲到出庫時間總計90 d)為研究起點，記為貯存0 d，每隔30 d進行跟蹤取樣，共采取5組樣品(0、30、60、90、120 d)。每次分別從3個曲庫采集3個平行樣，采樣方式為從曲堆中心曲層的四角和中心位置各選取1塊大曲。將每塊大曲粉碎過20目篩，各曲粉混勻后采用四分法濃縮至200 g作為1個樣本，共15個樣本，4 ℃冰箱保藏備用。

1.3.2 理化指標的測定

大曲水分、酸度、酒化力、酯化力、氨基酸態氮指標的測定參考文獻[11]。

1.3.3 大曲感官評定方法

由10位制曲技術人員，參考文獻[12]對大曲外表面、斷面、皮張、香味進行感官評價，詳見表1。

表1 大曲感官評分標準Table 1 Daqu sensory scoring criteria

1.3.4 大曲揮發性風味物質的測定

取1.3.1大曲樣品過40目篩，混合均勻后，取3 g大曲放入20 mL頂空瓶中，再加入30 μL 2-辛醇內標溶液(質量濃度為69.33 mg/L)，60 ℃平衡20 min，頂空吸附30 min，于250 ℃解析5 min后進行GC-MS分離鑒定，升溫程序參考文獻[13]。

定性分析方法：未知化合物經計算機檢索的同時與標準譜庫對比鑒定，保留匹配度>90%的組分。

定量分析方法：用2-辛醇為內標進行半定量，大曲樣品中鑒定的揮發性風味物質的濃度計算參考文獻[4]。

1.3.5 數據處理與分析

利用Excel 2007、Origin pro 2018C、IBM SPSS Statistics 23等統計軟件進行數據處理和分析。

2 結果與分析

2.1 不同貯存時間大曲理化生化指標值及感官評分差異性分析

將不同貯存時間成品大曲的理化生化指標值及感官評分進行單因素方差分析，結果如表2所示。

表2 不同貯存時間大曲理化生化指標值及感官評分Table 2 Different storage time Daqu physicochemical biochemical index value and sensory score

由表2可知，酸度、酯化力、氨基酸態氮含量及感官評分在不同貯存時間里均差異不顯著，這可能是貯存過程中曲坯水分和品溫較低，抑制了微生物的生長代謝，各種酶活性也被鈍化，從而對微生物產酸和產酯等方面沒有明顯影響。貯存0 d與貯存60 d成品大曲之間水分差異顯著，可能是曲坯內部的毛細管水分蒸發，致使水分含量顯著降低[14]。在貯存60～120 d 內大曲水分含量差異不顯著，可能是此階段曲坯含水量與環境空氣的相對濕度相平衡，影響了曲坯水分的蒸發[6]。酒化力是大曲液化力、糖化力和微生物產酒能力的綜合評價[15]。貯存0 d與貯存30 d成品大曲之間酒化力值差異顯著，由于在此階段水分和溫度的變化，可能導致產酒精酵母數量減少，使酒化力值顯著降低[16]。

2.2 不同貯存時間大曲揮發性風味物質分析

對不同貯存時間大曲樣本進行GC-MS分析，結合文獻[17-19]中報道的風味物質，共確定48種大曲風味物質，其中酯類18種、醛酮類5種、醇類5種、芳香類8種、烷烯類6種、吡嗪類6種，揮發性成分總離子流色譜圖見圖1，不同貯存時間大曲風味物質韋恩圖見圖2。

圖1 不同貯存時間大曲揮發性成分總離子流色譜圖Fig.1 Chromatogram of total ion flow of volatile components at different storage time

圖2 不同貯存時間大曲風味物質韋恩圖Fig.2 Different storage time Daqu flavor substances of the Venn diagram

根據48種大曲風味物質含量作聚類熱圖分析，見圖3。熱圖更能夠直觀地顯示不同貯存時間大曲中風味物質含量的差異及變化情況，顏色越深代表該物質含量越多。

圖3 不同貯存時間大曲風味物質熱圖分析Fig.3 Heat map analysis of Daqu flavor substances at different storage times

由圖2和圖3可知，不同貯存時間大曲中有31種共有風味物質，包括油酸乙酯、亞油酸乙酯、2,3,5,6-四甲基吡嗪等，其中油酸乙酯和亞油酸乙酯在各貯存時間大曲中含量都較高，可能與脂質降解生成的脂肪酸與醇類物質合成有關[20]。貯存0 d成品大曲中獨有2-苯基巴豆醛和2,6-二甲基吡嗪兩種物質，貯存90 d成品大曲中獨有2,5-二甲基吡嗪一種物質。2-苯基巴豆醛是含有不飽和醛基的風味物質，呈現花香和甜香，有研究報道谷物原料中的亞油酸和亞麻酸先經脂氧合酶氧化產生氫過氧化物，再進一步分解形成不飽和醛[21]。2,6-二甲基吡嗪和2,5-二甲基吡嗪具有烘焙和堅果香，被認為是中高溫大曲中的重要香氣物質[22]，這些吡嗪類物質的形成與美拉德反應和耐熱芽孢桿菌等微生物代謝有關[23]。

由圖3可知，5種大曲樣本可以很好的聚為三類：貯存30、60、90 d成品大曲聚為一類，貯存0、120 d 成品大曲分別單獨為一類。十二酸乙酯、十五酸乙酯、2,3,5,6-四甲基吡嗪等16種物質在貯存0 d成品大曲中含量較高；1-烯-3-辛醇和2,5-二甲基吡嗪這兩種物質在貯存90 d成品大曲中含量較高；油酸乙酯、亞油酸乙酯、1-十五烯等8種物質在貯存120 d成品大曲中含量較高。總體來看，隨貯存時間的延長，熱圖顏色越來越淺，風味物質含量整體呈減少趨勢，其中乙酸戊酯、乙酸乙酯、2,3,5,6-四甲基吡嗪等39種風味物質含量在貯存30 d后減少，這可能與物質揮發、氧化分解[18,24]及微生物轉化[25]等有關。

2.3 不同貯存時間大曲主要風味物質差異分析

從韋恩圖和風味聚類熱圖可知，不同貯存時間大曲中風味物質的種類數和含量存在差異，現結合風味物質含量相對百分比圖來研究各貯存時間大曲中48種風味物質組成結構，如圖4所示。利用軟件SPSS 22.0對不同貯存時間大曲的48種風味物質進行主成分分析[26](principal component analysis，PCA)，主成分的特征值和貢獻率見表3。

圖4 大曲風味物質相對百分比及總含量Fig.4 The relative percentage and total content of Daqu flavor substances

由表3可知，從不同貯存時間大曲樣本中提取主成分特征值>1的成分，其累計貢獻率在85%以上，能夠較好地代表原始數據所反映的信息。大曲樣本選擇主成分載荷系數絕對值在0.8以上的風味物質，并結合文獻[27-30]確定各大曲樣本中共有重要風味物質8種(乙酸戊酯、壬酸乙酯、乙酸乙酯、十八酸乙酯、苯乙醇、癸酸乙酯、2,3,5-三甲基吡嗪、2,3,5,6-四甲基吡嗪)，不同貯存時間大曲重要風味物質含量相對百分比見圖5。

表3 主成分的特征值及貢獻率Table 3 Eigenvalues contribution and cumulative contribution of principal components

由圖4可知，大曲的揮發性風味物質總含量隨貯存時間的延長而變化，總體呈下降趨勢，且風味物質種類數也逐漸減少，貯存0 d大曲樣品中風味物質種類數為47種，而貯存120 d大曲樣品中風味物質種類數減少到37種。貯存0、90 d的大曲樣品中酯類、烷烯類和醛酮類物質含量與總風味物質含量的比值分別排前3位，且這兩個時間點樣本中的這3類物質占比之和均達到90%以上，表明這兩種大曲樣品中風味物質構成較相似。貯存30、60 d的大曲樣品中酯類、醛酮類和芳香族類物質的含量與總風味物質含量的比值分別排前3位，且這兩個時間點樣本中的這3類物質占比之和均達到96%以上，表明這兩種大曲樣品中風味物質構成較相似。而貯存120 d大曲樣品中酯類、烷烯類和芳香族類物質含量與總風味物質含量的比值分別排前3位，表明貯存120 d大曲與其他貯存時間大曲樣品中的風味物質構成不相似。酯類物質的含量在不同貯存時間大曲樣本中均占優勢，其含量占總風味物質含量的72.70%～85.04%。大曲貯存0 d時酯類物質含量為6.68 μg/g，貯存30 d后酯類物質含量為3.62 μg/g，減少了45.79%。烷烯類物質含量在貯存過程中有一定增加，這與相關研究較為一致[19]。大曲貯存30 d時醛酮類物質含量為0.88 μg/g，貯存120 d后醛酮類物質含量為0.13 μg/g，減少了85.24%。芳香族類和吡嗪類物質在不同貯存時間大曲樣本中占比均差異不大，分別為4.27%～6.33%和0.80%～2.88%。

由圖5可知，貯存0 d的大曲樣品中壬酸乙酯、十八酸乙酯和苯乙醇含量與總重要風味物質含量的比值分別排前3位，且這3種物質占比之和為57.89%左右；貯存30、90 d的大曲樣品中苯乙醇、壬酸乙酯和乙酸乙酯含量與總重要風味物質含量的比值分別排前3位，且這3種物質占比之和均達60%以上；貯存60 d的大曲樣品中乙酸乙酯、苯乙醇、乙酸戊酯含量與總重要風味物質含量的比值分別排前3位，且這3種物質占比之和為72.43%左右；貯存120 d的大曲樣品中乙酸乙酯、苯乙醇、壬酸乙酯含量與總重要風味物質含量的比值分別排前3位，且這3種物質占比之和為75.61%左右。在不同貯存時間大曲中，苯乙醇含量與重要風味物質含量的比值為14.10%～40.60%，占比最大；2,3,5-三甲基吡嗪含量與重要風味物質含量的比值為1.15%～2.24%，占比最小。大曲貯存0 d時十八酸乙酯和2,3,5,6-四甲基吡嗪含量分別為0.23、0.16 μg/g，貯存120 d后十八酸乙酯和2,3,5,6-四甲基吡嗪含量分別為0.04、0.03 μg/g，分別減少了82.61%、81.25%；大曲貯存0 d時壬酸乙酯含量為0.27 μg/g，貯存30 d后壬酸乙酯含量為0.09 μg/g，減少了66.79%；大曲貯存30 d時乙酸乙酯含量為0.08 μg/g，貯存60 d后乙酸乙酯含量為0.20 μg/g，增加了60%。

圖5 大曲重要風味物質相對百分比Fig.5 Relative percentage of importantsubstances in Daqu

2.4 不同貯存時間大曲質量的重要影響因素分析

為進一步探究不同貯存時間大曲質量的重要影響因素，選取5種貯存時間大曲樣本的31種共有風味成分，對其含量、大曲理化生化指標值、感官評分運用Origin pro 2018C軟件進行PCA，結果如圖6所示。

圖6 不同貯存時間大曲樣品PCAFig.6 PCA of Daqu samples with different storage time注：1-2-乙基己醇;2-2,3-丁二醇;3-1-烯-3-辛醇;4-乙醛;5-仲辛酮;6-硅酸四乙酯;7-庚酸乙酯;8-辛酸乙酯;9-十二酸乙酯;10-癸酸乙酯;11-十八酸乙酯;12-油酸乙酯;13-壬酸乙酯;14-正己酸乙酯;15-十四酸乙酯;16-乙酸乙酯;17-亞油酸乙酯;18-乙酸戊酯;19-十六酸乙酯;20-十五酸乙酯;21-9-十六碳烯酸乙酯;22-苯乙醇;23-萘;24-苯乙烯;25-苯甲醛;26-2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚;27-1-十五烯;28-正十二烷;29-正十四烷;30-2,3,5,6-四甲基吡嗪;31-2,3,5-三甲基吡嗪

如圖6所示，第一、第二主成分的貢獻率分別為49.06%、32.51%，能較好地反映不同貯存時間大曲樣本原始信息。箭頭代表不同的理化生化指標、感官評分及風味化合物，其方向代表該指標對不同貯存時間大曲樣品中的影響取向，長短代表對不同貯存時間大曲理化指標值、感官評分及風味化合物含量的影響大小，并在大曲樣本中選擇主成分載荷系數絕對值在0.8以上的理化生化指標、感官評分及風味化合物做相關性分析。在圖6中，5種貯存時間大曲樣本中貯存0 d成品大曲分布在第一象限，苯甲醛(25)、十四酸乙酯(15)、壬酸乙酯(13)、2,3,5,6-四甲基吡嗪(30)等10種風味物質與其呈正相關，硅酸四乙酯(6)與其呈負相關；貯存30 d和60 d成品大曲分布在第二象限，酯化力指標和乙醛(4)與其呈正相關，十六酸乙酯(19)與其呈負相關；貯存90 d成品大曲分布在第三象限，硅酸四乙酯(6)與其呈正相關，苯甲醛(25)、十四酸乙酯(15)、壬酸乙酯(13)等10種風味物質與其呈負相關；貯存120 d成品大曲分布在第四象限，氨基酸態氮指標和癸酸乙酯(10)、2,3,5-三甲基吡嗪(31)、苯乙烯(24)等6種風味物質與其呈正相關，酯化力指標和乙醛(4)與其呈負相關。

綜上所述，從不同貯存時間大曲的理化生化指標值和感官評分分析，60 d和0 d的大曲樣本比較，除其水分含量以外，其余指標均沒有顯著性變化，其中，酯化力和感官評分分別增加了5.47%、5.03%；而5種大曲樣本中貯存60 d大曲的酯類物質含量占總風味物質含量較高，為83.92%，且60 d大曲樣本含有苯乙醇、2,3,5,6-四甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪等重要風味物質。綜合考慮庫房周轉，資金積壓等方面的經濟效益影響，建議成品大曲的最佳貯存時間為60 d，即從大曲發酵結束計算，實際貯存時間為120 d。

3 結論

對不同貯存時間大曲的理化生化指標值、感官評分分析表明，由于水分和溫度的影響，秋季安曲的不同貯存時間大曲，除了水分含量和酒化力值顯著變化以外，其余指標沒有顯著性變化。在5種大曲樣本中有31種共有風味物質，不同貯存時間成品大曲中均以酯類物質為主，其占比為72.70%～85.04%，且在重要風味物質中苯乙醇的占比較大，其含量占重要風味物質含量的14.10%～40.60%。成品大曲樣品中風味物質種類數和含量隨貯存時間的延長而變化，總體呈下降趨勢，乙酸戊酯、乙酸乙酯、2,3,5,6-四甲基吡嗪等39種風味物質含量在貯存30 d后減少，十八酸乙酯和2,3,5,6-四甲基吡嗪含量在貯存120 d后分別減少了82.61%、81.25%，這可能與物質揮發、氧化分解及微生物轉化等有關。由PCA可知，不同貯存時間大曲與其理化生化指標、感官評分及風味物質的相關性不同，其中與壬酸乙酯相關的主要是貯存0 d和貯存90 d大曲，與癸酸乙酯和氨基酸態氮指標相關的主要是貯存120 d大曲。綜合分析貯存60 d大曲的理化生化指標值、感官評分及風味物質，并考慮貯存時間對經濟效益的影響，建議成品大曲貯存時間為60 d，即從大曲發酵結束計算，實際貯存時間為120 d。由于不同貯存時間大曲品質不一致，建議不同貯存期的大曲可相互搭配使用，有利于控制窖池發酵參數，從而提高白酒品質。

本研究初步探明了貯存時間對大曲理化生化指標、感官評分及風味物質的影響，并在此基礎上建議了大曲的較佳貯存時間，但受到樣品數量的局限和風味物質檢測受多種因素影響，還需在實際生產中進一步探索和應用。此外，微生物的代謝活動和制曲微環境也是大曲質量的重要影響因素，結合高通量測序等技術探究大曲貯存期微生物的變化規律及對貯存過程中環境溫度、濕度等指標的監測，這將是今后的研究重點。