基于CRISPR技術的β-地中海貧血基因編輯的研究進展

賈吉宏，王春芳

(1.右江民族醫學院附屬醫院檢驗科，廣西百色 533000；2.右江民族醫學院研究生學院，廣西百色 533000)

β-地中海貧血(簡稱β-地貧)是因β-珠蛋白鏈缺失引起溶血和無效紅細胞生成的單基因遺傳病。正常情況下，胎兒在出生時γ-珠蛋白基因沉默，而成年β-珠蛋白基因開始表達。若胎兒γ-珠蛋白基因終身持續表達，便可緩解因β-珠蛋白基因缺乏而引起的貧血。因此治療性的激活γ-珠蛋白基因成為研究的重點。規律間隔成簇短回文重復序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)系統自2012年至今發展迅猛，并在治療地中海貧血的研究中取得了顯著成果。使用CRISPR/Cas9基因編輯技術、堿基編輯技術(base editor，BE)和引導編輯技術(prime editor，PE)糾正β-地貧患者造血干細胞(hematopoietic stem cells，HSCs)中的突變已被認為是有效產生血紅蛋白的新型治療方法。然而，基因編輯有其優勢的同時，也存在一些缺點。故本綜述的重點是闡述目前最先進的CRISPR技術在治療β-地貧中的研究進展，并比較它們在使用過程中的利與弊。

1 CRISPR技術在β-地貧中的應用

血紅蛋白是一種攜氧四聚體蛋白，由兩條類β-珠蛋白基因和兩條類α-珠蛋白基因(HBA1 和 HBA2)組成。α-珠蛋白簇由三個基因(ζ、α2、α1)組成，β-珠蛋白簇由五個基因(ε、Gγ、Aγ、δ和β)組成。孕早期，ε-珠蛋白基因沉默，γ-珠蛋白基因(HBG1/HBG2)活化，并與α-珠蛋白配對形成胎兒血紅蛋白(fetal hemoglobin，HbF)；胎兒出生時，γ-珠蛋白基因幾乎完全沉默，β-珠蛋白基因活化與α-珠蛋白基因配對形成成人血紅蛋白(HbA)并在成人期持續表達。當β-珠蛋白基因發生突變時，未配對的α-珠蛋白鏈相對過剩并沉積在紅細胞膜上形成有毒的不溶性內含物，造成溶血或無效紅細胞生成，最終引起β-地貧。

攜帶β-珠蛋白基因的新一代慢病毒載體在HSCs中已顯示出有效的轉導作用[1]。使用不同類型的慢病毒載體進行細胞轉導已應用于治療β-地貧和鐮狀細胞病(sickle-cell disease，SCD)的多項臨床試驗中，這些臨床試驗的初步結果顯示：血紅蛋白的持續生產、輸血需求的降低、生活質量的提高[2-3]。但其風險在于，在非靶點上半隨機地將轉導基因整合到基因組這個過程，容易產生異常轉錄引發腫瘤[4]。而基于CRISPR的基因組編輯技術可修飾單個基因組目標，并具有更高的編輯特異性。2020年，使用CRISPR技術首次成功治愈了β-地貧和SCD這兩種遺傳性血液病[5]。隨著基因編輯工具的進步，CRISPR/Cas9基因編輯技術、BE及PE相繼被人類發現，并在治療遺傳性疾病中得以廣泛應用。CRISPR/Cas9技術的設計過程簡便、編輯效率高且成本相對低廉，但仍存在較高的脫靶效應(OFE)，即由于靶序列的同源性，Cas9在非預期位點進行切割。現已經開發了多種減少或消除OFE的策略，包括設計合理的Cas9高保真變體[6]和優化的靶標設計[7]。CRISPR介導的堿基編輯技術是一種通過靶向改變單核苷酸變異或點突變來達到糾正致病突變的技術，它的主要優點是可以在不產生DNA雙鏈斷裂的情況下化學修飾目標序列的核苷酸堿基，減少了插入或缺失引起的突變。但在糾正多堿基突變引起的遺傳性疾病方面仍具有局限性。此時，一個新的精準基因編輯技術能夠有效實現多堿基之間的精準插入和刪除，且無需額外的DNA模板即可完成12種單堿基的自由轉換。它就是引導編輯技術，是基因編輯領域的重要革新，成為治愈地中海貧血的最有前景的技術。

1.1 利用CRISPR/Cas9再激活γ-珠蛋白基因上調HbF水平胎兒γ-珠蛋白基因通常在出生時被成年β-珠蛋白基因取代，完成胎兒到成人的“血紅蛋白開關”轉換[8]。若干預上述這一轉換，使γ-珠蛋白基因在患兒出生后仍持續存在，恰好彌補了β-珠蛋白基因的缺失或突變，并阻止過量未配對的α-珠蛋白鏈的沉淀和β-地貧中的無效紅細胞生成。目前，再激活胎兒 γ-珠蛋白基因成為治療β-地中海貧血的研究熱點。

B細胞淋巴瘤因子11A(B-cell lymphoma 11A，BCL11A)作為γ-珠蛋白基因沉默的主要調節因子，是上調HbF水平的有希望的靶標。CTX001是一種使用CRISPR/Cas9修飾自體CD34+造血干/祖細胞(HSPCs)降低BCL11A基因表達的產品，正在輸血依賴型β-地貧患者中進行研究。這項臨床試驗報道了一名輸血依賴型β-地貧女性患者接受了CTX001，其 HbF 水平持續升高并開始不依賴輸血，且未檢測出脫靶效應[9]。但在隨訪過程中出現了包括中性粒細胞減少癥、肝竇阻塞綜合征/肝小靜脈閉塞病、肺炎和淋巴細胞減少癥等不良反應。為解釋其原因，進一步發現BCL11A不僅調節造血干細胞的自我更新，而且影響B淋巴細胞的成熟和中樞神經系統的發育[10]。BCL11A 基因座包含三個DNase I超敏反應位點(DHS)，它們作為紅細胞特異性增強子，位于距轉錄起始位點+62、+58和+55 kb處[11]。+58處的DHS對于表達含有GATA1基序的基因至關重要，并且參與紅系譜系的形成[12]。使用 CRISPR/Cas9技術編輯HSPCs中+58 BCL11A紅系增強子的GATA1結合位點，可以減少BCL11A 在紅系譜系細胞中的表達，而不影響其他細胞內BCL11A水平，并促進γ-珠蛋白的合成，重新激活HbF的產生[13]。生物學家正計劃將BCL11A增強子編輯策略用于行業贊助的臨床試驗中。在臨床分級、細胞產品生產的擴大方案和進行安全性研究方面有一定的進展，開始了β-地貧基因治療的臨床試驗[14]。

另一種途徑是通過模擬遺傳性持續性胎兒血紅蛋白綜合征(hereditary persistence of fetal hemoglobin，HPFH)的相關突變來誘導HbF內源性表達。HPFH是一種良性疾病，表現為出生后γ-珠蛋白基因仍持續表達。當β-地貧合并HPFH時，γ-珠蛋白基因的重新激活使HbF水平升高，改善了α/β-珠蛋白鏈之間的不平衡，表現出較輕的臨床癥狀[15]。研究表明[14]，γ-珠蛋白基因啟動子上存在很多HPFH突變，其中位于轉錄起始位點上游約115 bp和200 bp區域的γ-珠蛋白基因啟動子的點突變與HbF水平升高有關。WANG等人[16]利用CRISPR/Cas9技術編輯CD34+HSPCs中BCL11A結合的HBG1/HBG2基因啟動子基序，產生γ-珠蛋白mRNA表達增加，并提高了紅系細胞分化率，且沒有檢測到脫靶突變效應。他們還發現了BCL11A 結合位點(TGACCA：-114至-119)對抑制γ-珠蛋白鏈至關重要，是堿基編輯器hA3A-BE3誘導突變和促進γ-珠蛋白基因表達升高的理想靶點[17]。使用電穿孔技術通過Cas9:sgRNA和hA3A-BE3:sgRNA RNP模擬HPFH患者HBG1基因啟動子(102～114)自然發生的13 bp等位基因缺失和-114 C>T，證明了源自β-地貧患者HSPCs中的HBG啟動子編輯破壞了BCL11A結合域，使γ-珠蛋白再激活[16]。近日，LIN等人[18]確定了TEA 結構域轉錄因子4(TEAD4)在γ-珠蛋白基因啟動子上的結合基序，它是通過直接與HBG啟動子結合來抑制γ-珠蛋白轉錄活性。研究使用CRISPR/Cas9破壞人臍帶血來源的紅系祖細胞系(human umbilical cord blood derived erythroid progenitor 2，HUDEP2)細胞中 HBG 啟動子上的TEAD4結合位點，檢測到的γ-珠蛋白表達顯著增加的同時未觀察到紅系分化的顯著差異。

其他幾種轉錄因子，包括 Krüppel樣因子1(KLF1)、SOX6、MYB等，在從胎兒血紅蛋白到成人血紅蛋白的轉換過程中起調節作用。KLF1可通過直接激活β-珠蛋白基因和間接抑制BCL11A水平以增加γ-珠蛋白基因表達這兩種方式來治療β-地中海貧血。并且有研究表明[19]，通過敲除KLF1基因抑制BCL11A比直接靶向BCL11A增強子所產生的HbF水平上調更加明顯，可高達25%，且未檢測到脫靶效應。但因其敲低所產生的不良影響，不建議作為β-地貧的潛在性治療途徑。SOX6作為抑制γ-珠蛋白基因的重要因子，SHARIATI等人[20]利用CRISPR/Cas9技術靶向敲除SOX6，有效上調HbF水平，充分證明了SOX6可作為β-地貧治療的靶點。MYB是紅系發育和HbF水平的關鍵調節調節因子。它通過激活人紅細胞中的KLF1和TR2/TR4，間接激活BCL11A基因，是一種強大的 γ-珠蛋白基因抑制因子[21]。上述通過CRISPR/Cas9基因編輯技術編輯BCL11A紅系增強子和HBG1/HBG2啟動子 TGCAAC基序能夠獨立誘導HUDEP2細胞中γ-珠蛋白基因的表達，表明單基因編輯是有效的，但它仍然存在一定的局限性。最近，HAN等人[22]提出了應用CRISPR/Cas9的多重基因組編輯策略編輯 HUDEP2細胞系和人外周血衍生的造血干細胞中BCL11A和γ-珠蛋白基因啟動子TGCAAC基序的DHS +58/祖細胞(HSPCs)，同時下調BCL11A表達并破壞γ-珠蛋白啟動子上的BCL11A結合位點，最終導致HbF水平表達更高。同時首次評估了多重基因編輯的脫靶事件，證明了多重基因編輯在HSPC中是有效且安全的，進一步拓寬了基因編輯治療β-地中海貧血的道路。

1.2 利用CRISPR/Cas9下調α-珠蛋白基因糾正α/β-珠蛋白鏈失衡β-地中海貧血無效紅細胞生成和溶血的主要原因是α-珠蛋白鏈相對過剩，過量的游離α-珠蛋白形成有毒沉淀物沉積于紅系前體細胞，觸發級聯事件產生活性氧。因此，β-地中海貧血患者中α-珠蛋白基因表達的下調可以改善甚至治愈β-地中海貧血。

臨床數據表明，β-地貧的嚴重程度與α-珠蛋白基因數量有直接關系，α-珠蛋白基因缺失明顯減緩了β-地貧患者的臨床癥狀及輸血需求[23]。最近的一項體外研究報道了使用CRISPR/Cas9基因組編輯技術刪除HBA2下調α-珠蛋白基因，重建α-地中海貧血性狀[24]。在這項研究中，研究人員設計了一種單向導RNA來靶向HBA1和HBA2基因的5'UTR，從而去除HBA2基因，顯示出α-珠蛋白基因mRNA的顯著減少和紅系細胞中的α-珠蛋白沉淀物的明顯減少，同時能夠保證足夠的血紅蛋白的合成。另一種下調α-珠蛋白基因的方法是敲除人CD34+細胞的MCS-R2 α-珠蛋白增強子，使α/β-珠蛋白鏈失衡恢復到正常水平。METTANANDA[25]通過試驗證明β-地貧患者紅系細胞中MCS-R2增強子的單等位基因缺失后可導致60%以上的α-珠蛋白鏈合成被敲低；MCS-R2增強子的雙等位基因缺失可導致約90%的α-珠蛋白鏈合成被敲低。為了更有效地糾正α/β-珠蛋白鏈失衡，PAVANI等[24]通過刪除HBA2基因來模擬α-地貧特征并在內源性HBA啟動子的控制下靶向整合和表達了β-珠蛋白轉基因，這種協同編輯使得α-珠蛋白下調的同時伴隨著β-珠蛋白的上調，高效改善了β-地貧患者紅系細胞中α/β-珠蛋白鏈的失衡。CROMER 等人[26]使用組合Cas9/AAV6基因組編輯方法將內源HBA1基因轉換為β-珠蛋白轉基因。盡管基因組編輯頻率低于預期水平，但仍顯示出可喜的結果。此外，若將下調α-珠蛋白的基因編輯方法與上調HbF的基因編輯技術相結合，以產生累加效應，可能成為更有效的治療β-地中海貧血的協同編輯方法。

1.3 堿基編輯技術相比隨機切斷基因序列，直接糾正異常基因點突變是改善疾病影響的理想方法。Liu的團隊在2016年報告了一種新的基于CRISPR的基因編輯方法：堿基編輯技術[27]。它可以在不需要進行雙鏈DNA斷裂的情況下用化學方法把一個堿基字母直接替換成另一個。BE已經用于糾正由單堿基點突變引起的遺傳疾病，包括最常見的SCD和β-地貧[16]。據研究發現，BE主要是通過模擬γ-珠蛋白基因啟動子上-198和-175 HPFH突變或通過精確的堿基替換破壞BCL11A增強子中的GATA1基序來上調HbF水平[28]，從而達到治療疾病的效果。并且Cas9直系同源物和工程變體的更新擴展了BE的靶向范圍[29]，使用新的工程變體能夠靶向HBG啟動子中的兩個區域[28]，但同時可能產生中間序列缺失的風險。脫氨酶的修飾減少了旁觀者編輯，產生更精確的BE，具有更高的產品純度和更窄的活性窗口[30]。然而，單堿基編輯技術在糾正多堿基突變引起的遺傳疾病方面仍具有局限性。

1.4 引導編輯技術ANZALONE等人[31]開發了一種用于單堿基編輯的改良CRISPR/Cas9系統：引導編輯技術。PE是一種“搜索和替換”基因組編輯技術，它可以在不需要dsDNA斷裂或供體DNA模板的情況下，在人類細胞中介導有針對性的靶向插入、刪除以及進行任何可能的堿基間的轉換[31]。PE使用催化受損的Cas9內切酶與工程逆轉錄酶聚合，并通過引導編輯向導RNA(pegRNA)進行編碼。pegRNA可以指定靶點，而且不需要dsDNA斷裂或供體DNA模板就能編碼所需的編輯片段[31]。由于PE可以在靠近或遠離原間隔相鄰基序(proto-spacer adjacent motif，PAM)的位置進行編輯，而不像其他方法那樣受到PAM的限制，所以它擴展了CRISPR基因組編輯的范圍。目前的研究已經對人類細胞進行了175種不同的DNA編輯，糾正了SCD的突變、移除了薩氏病基因中多余的致病堿基等。在此之前，沒有任何方法能夠不留下插入、缺失和其他可能干擾編輯細胞工作的基因碎片，還在如此多不同的細胞類型中進行如此廣泛的DNA改變[31]，為β-地貧的治療提供了新的方向。到目前為止，研究人員只對少數人類細胞類型進行了實驗，在PE應用于人類之前，還需進一步證明其安全性和有效性。

2 CRISPR基因編輯技術的利與弊

與 CRISPR/Cas9核酸酶系統相比，BE的主要優勢之一是它們能夠在不產生DSB的情況下引入精確的點突變。BE有效地糾正了人類細胞系中特定的堿基，但對于直接糾正SCD和神經節苷脂沉積病中常見的重要顛換及多個堿基的插入或缺失等方面存在限制。而PE解決了BE面臨的一些問題，如提高效率、精確的靶向插入和刪除、全部12種可能的堿基間的轉換等。但BE在最佳窗口效率要高于PE。當堿基編輯窗口中存在多個胞苷或腺嘌呤堿基，或者無法正確定位的PAM時，使用BE可能會發生不必要的旁觀者突變[32]。當無法接受旁觀者突變或者目標靶點缺少PAM時，PE與BE差別不大。在沒有旁觀者突變的情況下PE的效率高于BE。因此，對于存在多個胞嘧啶或腺嘌呤的目標基序且不希望出現旁觀者突變時，PE具有很大的優勢。另外，使用Cas9和pegRNA進行 PE復合修飾靶點的效率與使用sgRNA的CRISPR/Cas9相似，而PE修飾脫靶位點的效率比使用CRISPR/Cas9降低了4.4倍[33]。PE并不能像CRISPR/Cas9那樣完成大范圍的DNA插入或刪除。因此，它目前依然無法完全取代其他的基因編輯工具。

3 小結與展望

基于CRISPR技術的基因編輯在β-地中海貧血的治療中具有良好的前景。盡管新的CRISPR工具不斷涌現，但它們在人類造血干細胞中應用仍然較少，CRISPR/Cas9仍然是主導的基因工程工具。但CRISPR存在的脫靶效應、DNA損傷后的細胞毒性，以及免疫原性仍然是主要的限制因素。為了提高CRISPR編輯人類干細胞的效率和安全性，同時為體內目的優化輸送/移植，仍需要研究關鍵步驟。因此，在將其安全地應用于人類之前，需要進行更多的研究。但CRISPR技術充分發揮其潛力也只是時間問題。