參附注射液有效成分治療急性心肌梗死作用機制的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究*

藍 洲 陀 鵬 梁鐙月 朱冬玲 韋宜賓 鄧海霞 趙 旋（廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530021）

急性心肌梗死（AMI）的病理生理機制主要是因冠脈嚴(yán)重狹窄或易損斑塊的破裂而導(dǎo)致的急性血栓形成，或伴有血管收縮劑微血管栓塞，引起心肌缺血壞死。因其住院率及死亡率呈同比上升趨勢，且預(yù)后差，已嚴(yán)重威脅我國民眾健康［1］。因此，早期發(fā)現(xiàn)易損斑塊并進行藥物或器械等預(yù)防性治療是預(yù)防AMI的關(guān)鍵措施［2］。目前，進行緊急經(jīng)皮冠狀動脈介入治療（PCI）及溶栓是治療AMI的主要有效手段，最大限度地提高再灌注療效，但治療費用頗高，且存在較多的并發(fā)癥，如急性心力衰竭、交感風(fēng)暴等，尤其在出院后長期的預(yù)防用藥及心臟康復(fù)治療更給社會及家庭帶來沉重的經(jīng)濟負擔(dān)。故目前尋求有效的藥物防治AMI仍是難以攻克的問題。AMI屬于中醫(yī)學(xué)心系病證中“真心痛”范疇，其發(fā)病基礎(chǔ)是本虛，標(biāo)實是發(fā)病條件，臨床上以寒凝心脈證、正虛陽脫證為常見，故通常選用溫補心陽、回陽救逆、益氣固脫之方藥進行干預(yù)，研究證實能取得較好的臨床療效［3-4］。目前，由紅參、附子提取制作而成的參附注射液（SFI）具有很好的臨床應(yīng)用價值，且安全性能好，其主要生物活性源于人參皂苷及多類生物堿成分，兩者相輔相成，共同發(fā)揮藥物療效。多項研究表明，SFI可發(fā)揮抑制細胞凋亡、調(diào)節(jié)免疫等作用，對心肌細胞起保護作用，可明顯減輕心臟血管的再灌注損傷［5-6］。在AMI中，使用SFI得以補益陽氣、溫振心陽，從而達到治療目的［7］。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討SFI主要生物成分治療AMI的作用機制，旨在為進一步的實驗研究和臨床應(yīng)用提供思路。

1 資料與方法

1.1 SFI有效成分獲取 通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP）數(shù)據(jù)庫（https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）對SFI中所含中藥（紅參、附子）進行檢索，以生物利用度（OB）＞30%、類藥性（DL）＞0.18為標(biāo)準(zhǔn)進行篩選，其中OB是指中藥被吸收入人體循環(huán)的速度與程度，OB＞30%表示有效；DL指化合物與已知藥物的相似性，從而確定藥物的某種化合物是作用于人體的［8］。得到符合標(biāo)準(zhǔn)的成分（Ingredients）和相關(guān)靶點（Related Targets），進而得到藥物有效成分及靶點的信息表格圖。

1.2 AMI與SFI對應(yīng)分子靶標(biāo)的獲取 通過Gene-Cards數(shù)據(jù)庫（https//www.genecards.org）及在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫（OMIM）（https：//www.omim.org），以“AMI”為關(guān)鍵詞，采用Cytoscape 3.6.1軟件，檢索得到疾病的靶點，采用ActivePerl軟件、venny.R、Java插件、R軟件、UltraEdit等軟件分析，得到藥物靶點和疾病靶點交集部分，找出藥物對應(yīng)疾病的關(guān)鍵靶點，構(gòu)建疾病與藥物文恩圖，此處文恩圖指SFI有效成分中所對應(yīng)的靶點與AMI靶點相互交集的關(guān)系圖，并將其可視化。

1.3 AMI與SFI的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖及核心基因構(gòu)建 利用SRTING數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org），復(fù)制并輸入疾病與藥物相交集的靶基因，以“Homo sapiens”作為檢索條件，隱藏?zé)o關(guān)系的游離點，繪制出疾病與藥物間蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖，并高清輸出，統(tǒng)計并分析疾病與藥物基因蛋白之間的連線關(guān)系（基因蛋白間連線越多，則說明該基因蛋白在疾病與藥物關(guān)系中所起的作用越關(guān)鍵）。

1.4 基因本體生物學(xué)過程（GO-BP）富集分析及基因組百科全書（KEGG）通路分析 將疾病與藥物相交集的33個基因名字轉(zhuǎn)化為基因的ID，在R軟件中安裝citation（“DOSE”）、citation（“clusterProfiler”）、citation（“pathview”）等相應(yīng)的軟件包，修改相應(yīng)的公眾目錄，運行并構(gòu)成的網(wǎng)絡(luò)圖進行GO功能富集分析及KEGG的通路富集分析，以統(tǒng)計學(xué)P＜0.05為條件進行過濾，通過此步驟明確SFI是通過調(diào)節(jié)人體的何種功能或通路來達到治療AMI的目的。

2 結(jié) 果

2.1 SFI中有效成分 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫進行檢索，以O(shè)B＞30%、DL＞0.18作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，得到SFI有效成分共24個。有效成分包括谷甾醇（sitosterol）、次烏頭堿（hypaconitine）、β-谷甾醇（beta-sitosterol）、人參皂苷rh2（ginsenoside rh2）等，見表1。

表1 SFI中有效成分

2.2“SFI有效成分-靶點-AMI”文恩圖 見圖1。利用GeneCards數(shù)據(jù)庫及OMIM數(shù)據(jù)庫，以“AMI”為檢索關(guān)鍵詞，得到疾病的靶點共3 341個，如白細胞介素-6（IL-6）、FMS樣的酪氨酸激酶3（FLT3）、腫瘤壞死因子（TNF）、腫瘤蛋白p53（TP53）、非受體型酪氨酸蛋白激酶2（JAK2）、白細胞介素-10（IL-10）等，兩者取交集后獲得藥物成分疾病共同核心靶點33個，以文恩圖形式展現(xiàn)，其中藍色區(qū)域代表Disease（疾病-AMI），紅色區(qū)域代表Drug（藥物-SFI），暗紅色區(qū)域代表疾病與藥物相交集的核心靶點。

圖1 “SFI有效成分-靶點-AMI”文恩圖

2.3 SFI與AMI的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建 見圖2。利用SRTING數(shù)據(jù)（https：//string-db.org），復(fù)制并輸入疾病與藥物相交集的靶點，即文恩圖中兩者相交集的33個靶點，以“Homo sapiens”作為檢索條件，去掉游離無作用的單個蛋白靶點，在線網(wǎng)絡(luò)生成SFI與AMI的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖。由蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖可以得出，AMI與SFI關(guān)系較為緊密的蛋白分子有半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶 3（CASP3）、白細胞介素-1β（IL-1β）、半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶8（CASP8）、半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶1（CASP1）等。紫色連線表明PTGS2與CASP1、CASP3之間具有實驗論證的證據(jù)。JUN與CASP9既存在融合關(guān)系，也具有共表達關(guān)系。由此，筆者可以預(yù)測JUN、CASP3、IL-1β、CASP8、PTGS2等可能是SFI治療AMI的核心潛在靶點蛋白。

圖2 “AMI-SFI”蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 SFI中有效成分及靶點蛋白治療AMI的GO功能富集分析 見圖3。根據(jù)GO富集分析柱狀圖可知，筆者得到功能富集數(shù)目較多的活性物質(zhì)共20個，顏色的不同表明不同的富集關(guān)系，其中功能富集受體活動較強的5個是：G protein-coupled amine receptor activity（G蛋白偶聯(lián)的胺受體活性）、G protein-coupled neurotransmitter receptor activity（G蛋白偶聯(lián)的神經(jīng)遞質(zhì)受體活性）、postsynaptic neurotransmitter receptor activity（突觸后神經(jīng)遞質(zhì)受體活性）、acetylcholine receptor activity（乙酰膽堿受體活性）以及steroid hormone receptor activity（類固醇激素受體活性）。由此，筆者可預(yù)測SFI可能通過以上富集活性較強的受體，起到對AMI的干預(yù)作用。

圖3 SFI-AMI的GO功能富集柱狀圖

2.5 SFI中有效成分及靶點蛋白治療AMI的KEGG的通路富集分析 見圖4～圖5。由圖4可以統(tǒng)計總共有20條相關(guān)通路，根據(jù)富集的程度，IL-17 signaling pathway（IL-17信號通路）、TNF signaling pathway（TNF信號通路）、C-type lectin receptor signaling pathway（C型凝集素受體信號通路）、p53 signaling pathway（p53信號通路）、Calcium signaling pathway（鈣信號通路）、Toll-like receptor signaling pathway（Toll樣受體信號通路）、NOD-like receptor signaling pathway（NOD樣受體信號通路）、cAMP signaling pathway（cAMP信號通路）等通路在SFI治療AMI過程中關(guān)聯(lián)密切，同時與Lipid and atherosclerosis（脂質(zhì)和動脈粥樣硬化）、Hepatitis B（乙型肝炎）、Influenza A（甲型流感）、Measles（麻疹）等疾病存在關(guān)系。此外，筆者根據(jù)圖4中IL-17信號通路預(yù)測，IL-17E生成因子可能通過上調(diào)或下調(diào)某些細胞分子，誘發(fā)細胞凋亡，在DNA中表達成th2相關(guān)細胞因子或趨化因子，從而誘導(dǎo)th2細胞反應(yīng)或抑制th17細胞反應(yīng)，達到調(diào)控目的。

圖4 SFI-AMI的KEGG氣泡圖

圖5 IL-17信號通路圖

3 討 論

對于AMI來說，粥樣硬化斑塊破裂或糜爛所致的急性血栓形成，是最常見的發(fā)病原因。易損斑塊主要以纖維帽較薄、脂核大、富含炎癥細胞和組織因子為形態(tài)學(xué)特點，斑塊破裂則與體內(nèi)的炎癥細胞、淋巴細胞分泌的蛋白酶相關(guān)。目前，多項研究表明，已知SFI中的有效成分對心肌細胞缺血缺氧具有保護機制［9-11］。本研究中筆者通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，檢索得到參附注射液的主要有效成分，如β-谷固醇、人參皂苷rh2、芥子堿、谷甾醇、羥乙炔等。其中，β-谷甾醇廣泛存在于天然植物中，通過對β-谷固醇酯化反應(yīng)獲得了4種新的衍生物，發(fā)現(xiàn)其衍生物可大大提高抗氧化酶的活性，降低了腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、IL-1β和IL-6的水平，證實了其衍生物可對抗由TLR4和Nrf2途徑介導(dǎo)的LPS/GalN誘導(dǎo)的急性肝損傷，有抗干細胞損傷作用［12］。芥子堿不僅是一種非常有價值的天然抗氧化劑，還具有顯著的抗氧化、降血壓、抗炎等多種生物活性功能。筆者通過檢索相關(guān)中外文獻，發(fā)現(xiàn)人參皂苷rh2廣泛用于抗腫瘤、抗心肌缺血、調(diào)節(jié)免疫功能等方面。邵懇等通過對大鼠分組進行實驗，發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rh2可改善高脂大鼠氧化應(yīng)激與炎癥水平，增加大鼠心肌缺血再灌注后外周血EPCs數(shù)量，從而保護受損心肌［13］。同時，筆者發(fā)現(xiàn)SFI可能通過關(guān)系較為緊密的JUN、CASP3、IL1B、CASP8、PTGS2等蛋白分子，達到治療AMI的療效。吳林慧等通過實驗表明，Casp3可促進Jun的表達，達到抑制腎癌細胞的增殖，加快癌細胞凋亡的作用［14］。Caspase-3是一種蛋白酶，一般認(rèn)為Caspase-3是細胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶，也是CTL細胞殺傷機制的重要組成部分。Riedel等發(fā)現(xiàn)體內(nèi)尿酸對CASP3的不可逆轉(zhuǎn)抑制，可減少肝細胞凋亡［15］。CARD8和IL-1B多態(tài)應(yīng)激反應(yīng)可治療新生兒體溫過低的缺氧缺血性腦病［16］。此外，在GO功能富集分析上得出在SFI治療AMI中主要的蛋白活性受體，其中，G蛋白偶聯(lián)的胺受體活性具有自主神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)的功能，在AMI發(fā)病過程中，心肌耗氧量的增加以及心肌氧釋放的減少，如心跳加速、疼痛、發(fā)熱、低血壓等，均會導(dǎo)致心絞痛惡化加重或心源性休克。Katie發(fā)現(xiàn)腎上腺G蛋白偶聯(lián)受體激酶2在心力衰竭中交感神經(jīng)系統(tǒng)中具有調(diào)節(jié)作用［17］。研究發(fā)現(xiàn)，α7nACh受體激動劑可上調(diào)心肌細胞p-GSK-3βSer9蛋白表達，而p-NF-κB p65 Ser536蛋白表達下調(diào)，具有降低GSK-3β活性抑制炎性反應(yīng)，從而減輕大鼠心肌細胞缺氧復(fù)氧損傷［18］。

在KEGG的通路富集圖中筆者得到20條富集程度較高的通路。圖5顯示IL-17信號通路家族包含IL-17E、IL-17A、IL-17C等，此外，其受體家族包括IL-17RA、IL-17RB、IL-17RC等。2017年蘇靜麗等提出抑制IL-17可能是治療心肌缺血再灌注損傷的新型治療靶向通路［19］。而今，多項研究已證實，IL-17與多個器官缺血再灌注損傷的發(fā)病機制有關(guān)，尤其在心肌再灌注損傷中具有很好的抗缺血作用。郭梅等采用IL-17A對小鼠冠脈進行實驗，發(fā)現(xiàn)不同濃度IL-17A能夠促進原代心肌細胞凋亡，誘導(dǎo)Caspase-3、Bax表達，抑制Bcl-2及PI3K/Akt通路蛋白表達，起到保護心肌細胞的作用［20］。另有研究發(fā)現(xiàn)，心肌梗死后，IL-17A、IL-17F和IL-17受體的表達均升高，表明在心肌缺血再灌注損傷期間IL-17細胞因子及其受體的表達升高，IL-17可增強心肌梗死期間的心肌嗜中性粒細胞募集，促進梗死后的炎性反應(yīng)和凋亡反應(yīng)［21-22］。由此，筆者預(yù)測在治療AMI中，SFI可能靶向作用IL-17細胞因子或其家庭細胞因子，通過上調(diào)或下調(diào)作用誘發(fā)細胞凋亡，從而改善急性心肌梗死中心肌細胞的缺血缺氧。此外，筆者還發(fā)現(xiàn)TNF、C型凝集素受體及p53等信號通路與AMI、SFI同樣具有密切關(guān)聯(lián)，值得深入探索。

綜上所述，SFI中的有效成分在治療AMI中起重要角色作用，可調(diào)節(jié)相關(guān)細胞因子，與抗缺血缺氧、抑制凋亡和炎癥反應(yīng)等多個靶向通路聯(lián)系密切。本研究為SFI治療AMI的進一步臨床試驗研究提供了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)理論基礎(chǔ)，但其具體靶向分子作用機制需進行深入研究。