黃芪甲苷對射血分數(shù)保留型心力衰竭大鼠心臟功能保護及心肌微血管炎癥因子的影響*

崔梁瑜 馬 靜 張學學 薛松研 王方圓 許 航 張 莎

（1.陜西中醫(yī)藥大學，陜西 咸陽 712046；2.空軍軍醫(yī)大學西京醫(yī)院，陜西 西安 710032）

資料顯示，我國心力衰竭（HF）粗發(fā)病率為0.87/1 000人年，累積發(fā)病率為0.86%［1］。其中約有50%HF患者為射血分數(shù)保留型心力衰竭（HFpEF）［2］。西醫(yī)主要針對癥狀、心血管基礎(chǔ)疾病和合并癥、心血管疾病危險因素進行治療［3］，但目前還沒有發(fā)現(xiàn)可明顯改善HFpEF患者治療結(jié)果的方法，因此尋找針對HFpEF更有效安全的治療藥物，仍是心血管疾病領(lǐng)域研究的熱點之一。中醫(yī)藥治療具有多途徑、多靶點的優(yōu)勢，可以改善HFpEF的癥狀。研究顯示［4-5］，黃芪中的黃芪甲苷（AstragalosideⅣ）對HF有改善作用，可以促進血管生成、改善能量代謝、抑制心肌肥大、凋亡及纖維化，但能否改善HFpEF心臟功能尚未明確。本實驗旨在通過觀察黃芪甲苷對HFpEF模型大鼠的心臟功能保護及其作用機制，為HFpEF的治療提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 6周齡SPF級雄性鹽敏感（Dahl-ss）大鼠25只，體質(zhì)量（200±20）g，均購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，動物合格證號：SCXK（京）2016-0006。大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，飼養(yǎng)環(huán)境為晝夜12 h交替，室內(nèi)溫度控制在18～22℃，濕度控制在50%～60%，食物和水自由攝取。

1.2 試藥與儀器 黃芪甲苷（規(guī)格：60 g，純度：99.61%，中國Rskbio公司），加入去離子水攪拌均勻，配置為質(zhì)量濃度2.5 g/mL藥液，4℃冰箱冷藏備用。蘇木素染色液（中國Beyotime公司）；NT-ProBNP ELISA試劑盒（美國Cloud-Clone公司）；vWF抗體（Thermo Fisher Scientific公司）；VEGF、CD31、TNF-α和 IL-6抗體（美國Sigma公司）；生物素標記山羊抗兔IgG（H+L）（美國Sigma公司）；酶標儀（型號：EPOCH2，美國BioTek公司）；正置熒光顯微鏡（型號：Axioimager M1，德國CarlZeiss公司）；心電圖機（型號：Osciloscopio DS6064，美國ADInstruments公司）；彩色多普勒超聲（型號：IU22，荷蘭Phlips公司）。

1.3 分組與造模 將25只大鼠隨機分為正常對照組、模型組及黃芪甲苷低（10 mg/kg）、中（20 mg/kg）、高（40 mg/kg）劑量組［6-7］，每組5只。正常對照組用0.3%NaCl飼料喂養(yǎng)8周，其余各組采用8%NaCl高鹽飼料喂養(yǎng)8周進行HFpEF模型制備。當LVEF≥50%，BNP＞100 pg/mL，NT-ProBNP＞300 pg/mL，心率增快，提示模型制備成功。

1.4 給藥方法 HFpEF模型制備成功后，黃芪甲苷低、中、高劑量組分別按黃芪甲苷10、20、40 mg/kg灌胃8周。正常對照組、模型組灌胃等量蒸餾水。

1.5 心電圖檢查 于末次灌胃24 h后，麻醉大鼠并固定于鼠板上，連接心電圖機，心率穩(wěn)定3 min后記錄心電圖。

1.6 標本采集與檢測 1）ELISA法檢測NT-ProBNP：心電圖記錄完畢后，大鼠開胸取血，抽取血液5 mL，離心取上清，96孔板中分別加入不同濃度標準品稀釋液后，加血清50 μL/孔，采用ELISA法檢測NT-ProBNP含量。2）免疫熒光染色：取出完整心臟，心肌組織脫水、浸蠟和包埋，切片厚度為5 μm，脫蠟，滴加山羊血清封閉后PBS沖洗，依次加入一抗（vWF抗體、CD31抗體）、生物素標記山羊抗兔IgG（H+L）后封片，檢測心臟組織CD31、vWF表達。3）免疫組化染色：心肌組織切片脫蠟，PBS沖洗以后，加抗原修復液，低火加熱，PBS沖洗，內(nèi)源酶滅活，采用3%的H2O2室溫避光孵育，PBS沖洗，依次加入一抗（VEGF抗體、TNF-α抗體和IL-6抗體）、生物素標記山羊抗兔IgG（H+L）、辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，PBS沖洗；DAB顯影，蘇木素染色液復染，脫水，透明，封片，檢測VEGF、TNF-α和IL-6。

1.7 統(tǒng)計學處理 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（）表示，各個組間進行比較時采取單因素方差分析法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠超聲心動指標比較 見圖1，表1。模型組大鼠較正常對照組大鼠LVEF值降低，舒張期室間隔厚度（IVSd）值升高，有統(tǒng)計學差異（P＜0.05），左心室舒張末期內(nèi)徑（LVIDd）和左室后壁舒張期厚度（LVPWd）值差異不明顯（P＞0.05）。與模型組相比，黃芪甲苷低、中、高劑量大鼠LVEF值升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），中、高劑量組IVSd顯著降低（P＜0.05）；LVIDd和LVPWd值差異不明顯（P＞0.05）。

圖1 各組實驗大鼠超聲心電圖

表1 各組大鼠超聲心動指標比較（±s）

表1 各組大鼠超聲心動指標比較（±s）

注：與模型組相比，*P＜0.05，**P＜0.01；與黃芪甲苷低劑量組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與黃芪甲苷中劑量組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。下同。

組 別n LVEF（%）IVSd（mm）LVIDd（mm）LVPWd（mm）5 5 5 5 5正常對照組模型組黃芪甲苷低劑量組黃芪甲苷中劑量組黃芪甲苷高劑量組76.10±2.92*53.81±2.84 61.71±5.82*68.50±2.79*△72.58±4.38*△1.83±0.02*2.15±0.06 2.32±0.46 1.99±0.03*1.91±0.03*▲▲7.69±0.46 7.88±0.71 7.76±0.16 7.98±0.08△7.87±0.57 1.90±0.04 2.02±0.08 2.03±0.16 2.03±0.15 2.11±0.12

2.2 各組大鼠血清NT-ProBNP水平比較 見表2。與正常對照組相比，模型組大鼠血清NT-ProBNP顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，黃芪甲苷低、中、高劑量組大鼠血清NT-ProBNP均有不同程度的降低（P＜0.05）。

表2 各組大鼠血清NT-ProBNP表達水平比較（pg/mL，±s）

表2 各組大鼠血清NT-ProBNP表達水平比較（pg/mL，±s）

組別正常對照組模型組黃芪甲苷低劑量組黃芪甲苷中劑量組黃芪甲苷高劑量組n5 5 5 5 5 NT-ProBNP 123.13±9.30*373.77±13.61 305.70±19.17*236.10±18.39*△△155.20±21.00*△△▲▲

2.3 各組大鼠心臟組織CD31表達比較 見圖2，表3。各組大鼠心肌組織微血管內(nèi)皮細胞均可見綠色CD31表達。與正常對照組相比，模型組CD31表達量顯著下降（P＜0.05）；與模型組相比，黃芪甲苷高劑量組CD31表達增加（P＜0.05）。

表3 各組大鼠心肌組織CD31、vWF熒光表達量比較（%，±s）

表3 各組大鼠心肌組織CD31、vWF熒光表達量比較（%，±s）

組別正常對照組模型組黃芪甲苷高劑量組n5 5 5 CD31 13.10±0.50**4.99±0.60 10.62±1.80*vWF 2.65±0.29**13.04±0.47 4.39±0.82*

圖2 各組大鼠心肌組織的CD31熒光染色（400倍）

2.4 各組大鼠心臟組織vWF表達比較 見圖3，表3。大鼠心肌組織微血管內(nèi)皮細胞可見綠色血管性血友病因子（vWF）的陽性表達。與正常對照組相比，模型組vWF陽性表達量顯著增加（P＜0.05）；與模型組相比，黃芪甲苷高劑量組vWF的陽性表達降低（P＜0.05）。

圖3 各組大鼠心肌組織的vWF免疫熒光染色（400倍）

2.5 各組大鼠心臟組織VEGF表達比較 見圖4，表4。各組大鼠心肌組織微血管壁周圍可見VEGF蛋白表達。與正常對照組相比，模型組黃褐色顆粒顯著減少，VEGF表達量顯著降低（P＜0.05）；與模型組相比，黃芪甲苷高劑量組VEGF的蛋白表達增加（P＜0.05）。

圖4 各組大鼠心肌組織的VEGF表達（免疫組化染色，400倍）

表4 各組大鼠心肌組織VEGF、TNF-α、IL-6表達比較（%，±s）

表4 各組大鼠心肌組織VEGF、TNF-α、IL-6表達比較（%，±s）

組別正常對照組模型組黃芪甲苷高劑量組n5 5 5 VEGF 10.57±0.63*4.85±0.11 7.78±0.24*TNF-α 2.03±0.17**5.11±0.16 2.93±0.30**IL-6 3.10±0.25*6.15±0.22 3.18±0.59*

2.6 各組大鼠心臟組織中TNF-α和IL-6表達比較 見圖5，表4。各組大鼠心肌組織中內(nèi)皮細胞周圍均可見少量TNF-α、IL-6表達（黃褐色顆粒）。與正常對照相比，模型組TNF-α、IL-6蛋白表達明顯增加（P＜0.05）；與模型組相比，黃芪甲苷高劑量組TNF-α、IL-6表達減少（P＜0.05）。

圖5 各組大鼠心肌組織的TNF-α、IL-6表達（免疫組化染色，400倍）

3 討 論

HFpEF發(fā)病率日益升高，且在一項急性失代償性心力衰竭（ADHF）患者的抽樣實驗中發(fā)現(xiàn)ADHF住院趨勢增加主要由HFpEF引起［8］，以ACEI、ARB為代表的西藥雖然具有血管保護作用，但多項薈萃分析顯示對HFpEF預后沒有明顯改善［9］。因此探索中醫(yī)藥治療，為HFpEF治療提供更多思路具有重要意義。根據(jù)臨床表現(xiàn)，HFpEF屬于中醫(yī)學的“心悸”“水腫”等范疇，主要病機為氣虛水停［10］，治療多用“補氣利水”之法。中藥黃芪有補氣固表、利尿生肌功效，可以改善HF癥狀，主要成分黃芪苷中黃芪甲苷生物學活性最好。黃芪甲苷具有促進血管生成、抑制心肌肥厚和纖維化等作用［11］，但對于HFpEF的心臟保護作用及相關(guān)機制未見報道。

高鹽攝入引起的高血壓誘發(fā)全身性氧化應(yīng)激和炎癥狀態(tài)，導致IL-6和TNF-α升高，在HFpEF患者的橫斷面研究中表達增多［12］。TNF-α和IL-6可抑制心肌細胞收縮，誘導炎癥激活，引起微血管炎癥和功能障礙。TNF-α通過調(diào)節(jié)環(huán)氧合酶2（COX-2）增加血管通透性，誘導內(nèi)皮黏附分子的表達，增強白細胞與內(nèi)皮細胞之間的黏附作用［13］；IL-6發(fā)揮負性肌力作用，通過gp130/STAT3途徑促進心肌細胞肥厚［14］，導致組織損傷和心臟功能障礙。全身性炎癥狀態(tài)影響冠狀動脈微血管內(nèi)皮功能，HFpEF患者心肌活檢樣品中觀察到的血管細胞黏附分子（VCAM）和E-選擇素高表達為此提供證據(jù)［15］。vWF作為炎癥的標志，是血管內(nèi)皮標志物，也是血管功能障礙的指標。在一項HFpEF患者10年的長期隨訪實驗中發(fā)現(xiàn)，vWF是HFpEF患者風險評估的潛在生物標志物［16］。黃芪甲苷通過激活自噬，減輕心肌肥大，減少炎癥實現(xiàn)心臟保護作用，可以通過絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）和NF-κB信號通路抑制炎癥和凝血介質(zhì)的表達［17］。在一項異丙腎上腺素誘導的大鼠心肌損傷模型實驗中發(fā)現(xiàn)黃芪甲苷可以有效抑制主動脈中 IL-1β、IL-6、TNF-α 的 mRNA 表達［18］。CD31位于中性粒細胞、血小板和內(nèi)皮細胞的連接處，參與血管生成，是血管內(nèi)皮細胞主要標志物之一，是反應(yīng)側(cè)支循環(huán)的最可靠指標［19］。VEGF在內(nèi)皮生成中至關(guān)重要，通過VEGF R1/R2發(fā)出的典型VEGF信號傳導調(diào)節(jié)幾種酶的活性，最終參與血管生成過程。Lin Li等［20］發(fā)現(xiàn)黃芪甲苷可通過PPARγ依賴性方式將巨噬細胞從M1轉(zhuǎn)化為M2表型，或激活PTEN/PI3K/Akt信號通路促進心肌梗死后的血管生成和心臟保護，促進血管生成，增加VEGF的蛋白質(zhì)表達。

冠狀動脈微血管內(nèi)皮在全身炎癥狀態(tài)下產(chǎn)生活性氧（ROS），從而限制臨近心肌細胞的一氧化氮（NO）生物利用度，導致心肌細胞中蛋白激酶G（PKG）活性降低。PKG活性降低導致心肌細胞肥大，左心室重塑，且由于細胞骨架蛋白低磷酸化使心肌細胞僵硬。心肌細胞僵硬和成纖維細胞增加引起膠原蛋白沉積，從而引起HFpEF舒張功能障礙［21］。

本實驗中模型組大鼠較正常對照組LVEF值明顯降低，但仍大于50%，收縮功能未受到明顯影響，黃芪甲苷低、中、高劑量組與模型組相比，IVSd降低，說明黃芪甲苷可以改善心肌收縮功能、減輕心肌肥厚。黃芪甲苷低、中、高劑量組較模型組血清BNP和NT-ProBNP降低，心肌細胞排列較整齊，血管壁結(jié)構(gòu)完整規(guī)則，提示黃芪甲苷對心臟功能有保護作用，且黃芪甲苷高劑量組大鼠與模型組相比，vWF的陽性表達明顯減少，說明黃芪甲苷可以改善心臟內(nèi)皮細胞功能，能夠抑制內(nèi)皮細胞損傷以后誘發(fā)的一系列反應(yīng)，有效緩解心臟微循環(huán)障礙，減緩HFpEF的進一步發(fā)展，改善HFpEF預后。與模型組相比，黃芪甲苷高劑量組的TNF-α和IL-6蛋白呈現(xiàn)不同程度的下降，說明黃芪甲苷能夠減少炎癥發(fā)生，改善內(nèi)皮細胞功能，減緩HFpEF的發(fā)展進程。與模型組相比，黃芪甲苷高劑量組的VEGF蛋白增多，表明高劑量黃芪甲苷能夠改善內(nèi)皮細胞功能，減緩HFpEF的發(fā)展進程。

本實驗驗證了黃芪甲苷對HFpEF模型大鼠的心臟功能具有保護作用，為HFpEF的治療提供實驗依據(jù)。黃芪甲苷高劑量組與模型組比較，結(jié)果提示黃芪甲苷對HFpEF模型大鼠心臟保護功能可能與抑制心肌組織炎性反應(yīng)、改善心肌微血管功能和心肌損傷有關(guān)，但因HFpEF疾病本身異質(zhì)性，相關(guān)機制仍需進一步探討。

圖6 實驗機制圖