青黛對急性潰瘍性結腸炎小鼠模型結腸黏膜中性粒細胞遷移浸潤的作用影響*

寇富舜 程 媛 李亞蘭 石 磊 史 瑞 丁龐華 施曉軍 李軍祥△（.北京中醫藥大學，北京 0009；.北京中醫藥大學東方醫院，北京 00078）

潰瘍性結腸炎（UC）是一種好發于結直腸的非特異性炎癥疾病［1］，其病變主要在大腸黏膜及黏膜下層，本病發病高峰在15～45歲，具有難治愈、易復發、癌變風險高的特點［2］。UC患者首次發病后，高達90%的患者會復發一次或多次，并且最初2年內復發或活動性逐漸增加，其中多達一半的患者從最初的直腸或直腸及乙狀結腸向心發展擴大炎癥范圍，約有10%直腸型UC患者發展為全結腸型［3］。目前UC的治療主要包括有5-氨基水楊酸、激素、免疫抑制劑等藥物治療以及外科手術切除。其發病機制多涉及遺傳易感性，環境因素、菌群失調和免疫反應失調等。其中不恰當的免疫激活造成了腸黏膜屏障的損傷，進而引發UC。青黛具有清熱解毒、涼血定驚的功效，在臨床上多用于治療各種黏膜潰瘍性疾病，目前的基礎研究也證實青黛對UC黏膜愈合具有促進作用［4］。本文旨在觀察青黛對UC小鼠結腸黏膜中性粒細胞遷移浸潤以及抗炎的作用影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級雄性C57BL/6小鼠40只，7～8周，體質量（20±2）g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供（合格證號：SCXK-2019-0013）。本研究中涉及小鼠的所有實驗程序均經北京中醫藥大學動物倫理委員會批準（No.BUCM-4-2020122103-4168）。

1.2 試劑與儀器 青黛配方顆粒（華潤三九醫藥股份有限公司）；美沙拉嗪緩釋顆粒劑（艾迪莎，上海愛的發制藥有限公司，國藥準字H20143164）；葡聚糖硫酸鈉（DSS）（美國MP Biomedicals公司，批號S0433）；便隱血試劑（珠海貝索生物技術有限公司，批號BA-2020B）。小鼠髓過氧化物酶（MPO）ELISA檢測試劑盒、小鼠TNF-α ELISA檢測試劑盒及小鼠IL-6 ELISA檢測試劑盒（美國Cusabio公司提供）。RPMI1640（Hy-Clone）；PBS、D-Hank's、紅細胞裂解液（索萊寶公司）；膠原酶Ⅲ（Worthington）；Percoll分離液（GE Healthcare）；小鼠流式抗體：CD45-Pacific BlueTM dye、CD11b-PE-Cy5、Ly6G-APC（Bio-Legend）。流式細胞儀（Beckman Coulter，Cyto-FLEX）。

1.3 造模與分組 將40只小鼠按隨機數字表法分為空白組、模型組、青黛組、陽性藥組，每組各10只。常規適應性飼養7 d，第8天開始，除空白組外，其余各組均予2.5%DSS溶液代替飲用水，自由飲水7 d，隔天更換1次。于第15天停止造模，更換無菌水自由飲用，并開始給藥，連續給藥7 d。于第21天麻醉并處死動物［5-6］。

1.4 藥物干預 根據前期研究，按照人與小鼠體表面積等效換算，得出青黛組給藥劑量［7］。青黛組：小鼠給予青黛，劑量為455 mg/（kg·d）溶于5%羧甲基纖維素鈉（CMC）制成青黛混懸液。陽性藥組（艾迪莎）：小鼠給予美沙拉嗪，劑量為606.67 mg/（kg·d），碾碎顆粒包衣溶于5%CMC中。灌胃時根據小鼠體質量給藥（0.1 mL/10 g），連續給藥7 d。

1.5 標本采集 1）實驗過程記錄小鼠疾病活動指數評分（DAI），DAI=（體質量下降指數+糞便性狀評分+糞便潛血評分）/3（見表1）。實驗結束后麻醉小鼠，取肛門至回盲部的結腸。每組隨機選擇5只進行中性粒細胞流式檢測，剩余5只留取結腸，一部分固定在4%多聚甲醛中，另一部分保存在液氮中進行相關指標檢測。2）流式結腸組織和腸系膜淋巴結（MLN）制備單細胞懸液。提取小鼠結腸組織，將組織剪成小塊后用含5 mmol/L EDTA的D-Hank's液洗滌2次，每次20 min；然后用冰PBS清洗組織3遍，用含1 mg/mL膠原酶Ⅲ的RPMI1640溶液消化60 min，加入同等體積的PBS放置冰上5 min終止消化，后用70 μm的細胞篩過濾，離心收集細胞沉淀。腸系膜淋巴結使用研磨棒研磨，70 μm的細胞篩過濾，離心收集細胞沉淀。隨后再次經冰PBS洗滌2次，置于40%Percoll分離液中進行梯度離心，而后用紅細胞裂解液裂解，冷PBS洗滌1次離心得到結腸固有層單細胞以及腸系膜淋巴結單細胞。重懸于0.5%BSA的PBS溶液中計數，并取1×106個細胞用于流式細胞術檢測。

表1 疾病活動指數評分標準

1.6 指標監測 1）HE染色。取結腸組織用4%多聚甲醛溶液固定24 h。分別置于70%、80%、90%、95%、100%不同梯度酒精中脫水，二甲苯透明，而后包埋成蠟塊，用切片機將其制備成5 μm組織切片。使用蘇木精染色5 min，清洗后伊紅染色30 s，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察結腸組織的病理變化。2）中性粒細胞檢測。前述制備的腸固有層組織單細胞懸液，對于中性粒細胞的檢測，加入熒光素標記的anti-mouse CD45、anti-mouse CD11b以及anti-mouse Ly6C等抗體，冰上避光孵育30 min；最后用含0.5%BSA的PBS洗滌2次后重懸，待上機檢測。框門策略：中性粒細胞（Neutrophil）：CD45+CD11b+Ly6G+。3）ELISA檢測。采用ELISA試劑盒檢測各組小鼠結腸組織中TNF-α、IL-6、MPO的表達，步驟均嚴格按試劑盒說明書進行操作，使用酶標儀在450 nm波長下測定吸光度，標準曲線計算濃度。樣本做復孔后計算平均值，算出每例的蛋白含量，最后用于統計分析。

1.7 統計學處理 應用SPSS16.0統計軟件。計量資料以（）表示，方差齊采用獨立樣本t檢驗，方差不齊采用近似t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組小鼠一般情況 見表2。通過DSS誘導小鼠UC模型，給予青黛混懸液及陽性藥進行干預。造模第3天時出現稀便、血便，大便末端有黏液或膿點，小鼠逐漸出現拱背、厭食、萎靡、懶動等表現；造模第7天時，造模小鼠均出現體質量明顯下降，黏液膿血便。隨后給藥7 d，至取材前1 d，模型組仍有血便，陽性藥組小鼠黏液膿血便消失，但見有稀軟便；青黛組小鼠黏液膿血便消失，可見有便潛血試紙陽性，稀軟便。與模型組相比，青黛組和陽性藥組可以顯著降低小鼠的DAI評分，差異具有統計學意義（P＜0.05）；從體質量下降率可以看出青黛組對體質量變化弱于5-ASA組。

表2 各組小鼠體質量及DAI評分比較（±s）

表2 各組小鼠體質量及DAI評分比較（±s）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與空白組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

組別空白組模型組青黛組陽性藥組n 10 8 8 9體質量下降率（%）0 0.194±0.016△△0.092±0.031*0.085±0.041*DAI評分（分）0 3.750±0.083△△2.250±0.344**1.333±0.680*

2.2 各組小鼠結腸黏膜情況 見圖1。HE染色觀察各組腸組織病理學改變，模型組小鼠腸黏膜可見上皮細胞壞死，隱窩結構減少乃至消失，炎性細胞浸潤等病理改變，與模型組相比，青黛組可見黏膜上皮結構較為完整，以及少量炎性細胞，而陽性藥組效果優于青黛組，黏膜結構完整。

圖1 各組小鼠結腸組織（HE染色，50倍、150倍）

2.3 各組小鼠結腸及腸系膜淋巴結的中性粒細胞比例比較 見圖2，表3。流式細胞術分析小鼠結腸黏膜固有層以及腸系膜淋巴結的中性粒細胞比例，在模型組小鼠結腸黏膜固有層中，中性粒細胞比例明顯高于空白組小鼠，而青黛組中性粒細胞比例明顯下降（P＜0.05或P＜0.01）。而在腸系膜淋巴結中可以看到與結腸相反的中性粒細胞比例，模型組小鼠中性粒細胞比例下降，而青黛組中性粒細胞比例升高（P＜0.01）。通過腸系膜淋巴結與腸固有層中性粒細胞的比例可以發現模型組數值最低，而青黛及空白組明顯高于模型組，差異具有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。說明在結腸炎狀態下，中性粒細胞由腸系膜淋巴結向結腸遷移，而后青黛能夠逆轉這一趨勢。

圖2 各組小鼠結腸固有層及MLN的中性粒細胞比例

表3 各組小鼠結腸及腸系膜淋巴結的中性粒細胞比例比較（±s）

表3 各組小鼠結腸及腸系膜淋巴結的中性粒細胞比例比較（±s）

組別空白組模型組青黛組n 5 4 4結腸固有層（%）1.450±0.346 12.700±1.015△△4.787±0.947**△腸系膜淋巴結（%）0.266±0.024 0.143±0.012△0.930±0.133**△△腸系膜淋巴結/結腸固有層0.183±0.061 0.011±0.002△0.203±0.034**

2.4 各組小鼠TNF-α、IL-6、MPO水平比較 見表4。與空白組對比，模型組中炎癥因子TNF-α、IL-6、MPO表達水平顯著升高（P＜0.01）；而與模型組相比，青黛組TNF-α、IL-6、MPO含量皆有明顯降低（P＜0.01）。這提示了青黛可以有效抑制DSS誘導的急性結腸炎的炎癥反應。

表4 各組小鼠結腸TNF-α、IL-6、MPO水平比較（pg/g，±s）

表4 各組小鼠結腸TNF-α、IL-6、MPO水平比較（pg/g，±s）

組別空白組模型組青黛組n 5 4 4 TNF-α 835.60±30.31 1 505.01±7.190△△985.00±21.70**△IL-6 153.60±4.13 277.03±4.67△△187.33±8.08**△MPO 3 463.00±152.30 5 226.15±46.33△△4 122.06±122.70**△

3 討論

UC是炎癥性腸病的主要類型。雖然其發病機制尚不清楚，但大量證據表明，UC發生在遺傳易感人群中，由于對腸腔抗原的免疫反應異常，導致持續的、無法控制的炎癥。許多免疫細胞浸潤UC患者的結腸，而腸黏膜損傷總是發生在中性粒細胞浸潤的區域［8］。中性粒細胞是在對組織損傷或感染的先天免疫反應期間募集到發炎部位的主要細胞。它們對刺激非常敏感，可以在幾分鐘內大量到達炎癥和組織損傷區域，在損傷部位產生具有抗菌潛力的活性氧，中性粒細胞彈性蛋白酶（NE）和MPO，它們促進中性粒細胞外陷阱（Net）的形成，而Net在UC炎癥過程中進一步放大了炎癥信號，發揮了維持和增強炎癥損傷的作用［9］。目前研究證實，在誘導緩解過程中，組織學上中性粒細胞的完全消失可以顯著改善UC的長期治療結局［10］。因此，抑制中性粒細胞在結腸黏膜浸潤對于抑制UC黏膜的炎癥損傷從而維持緩解至關重要。

青黛具有清熱涼血、解毒消斑，促進瘡瘍愈合等功效，《本草正義》中記載青黛“治瘟疫熱毒發狂……癰瘍腫毒”。《本經逢原》中見青黛“散郁火，治溫毒發斑及產后熱痢下重”。青黛被廣泛用于治療潰瘍性結腸炎的復方中，如青黛散、復方青黛顆粒、錫類散、潰結靈、清腸溫中方等［11］。一項多中心隨機對照試驗亦證實青黛可有效誘導UC患者的臨床反應［12］。基礎研究亦證實青黛被證明可以防治DSS誘導的腸道炎癥，這與通過激活芳烴受體（AHR）上調IL-10和IL-22，從而發揮抑制炎癥的作用［13］。青黛還可通過腸道內丁酸鹽的產生以及相應受體發揮調節DSS模型的腸道菌群以及代謝［7］。Xiao等研究表明青黛可顯著降低DSS誘導的巨噬細胞浸潤和TNF-α、IL-1β、IL-6和MCP-1等炎性因子表達［14］，還可通過抑制Th1/Th17細胞的炎性反應來緩解結腸炎癥［15］。馬文強等發現青黛能減輕DSS誘導的小鼠潰瘍性結腸炎的炎癥反應、氧化應激和細胞凋亡［4］。由此可以看出，青黛治療UC具有明確效果，并且能夠發揮抑制炎癥等調控作用。

目前青黛調節中性粒細胞方面研究較少，Lin等發現青黛可通過抑制MAPK激活和鈣離子的調節中性粒細胞的抗炎作用［16］。同時有證據表明中性粒細胞在某些情況下可能會離開組織損傷部位并遷移回脈管系統，這種反向遷移的作用及其對炎癥消退的貢獻仍不清楚［17］。在本研究中，通過建立小鼠急性DSS模型，觀察了青黛對小鼠急性結腸炎模型中中性粒細胞遷移浸潤，以及TNF-α、IL-6和MPO表達的影響。結果表明青黛可減少中性粒細胞向腸固有層的遷移浸潤，增加腸系膜淋巴結中中性粒細胞比例，這可能與中性粒細胞的反向遷移機制相關。同時還可顯著降低炎性因子TNF-α、IL-6和MPO表達從而發揮抑制炎癥而治療UC的作用。本實驗初步探討了青黛對急性結腸炎中中性粒細胞的遷移浸潤影響，為UC的中藥治療以及青黛在臨床上的進一步應用奠定了基礎，而青黛是否能夠對中性粒細胞浸潤形成的胞外陷阱具有調控作用，從而緩解UC這一機制仍需進一步研究。