芪仙通絡(luò)方對(duì)MACO大鼠髓鞘再生及MBP表達(dá)的影響研究*

黃 佳 趙建濤 羅曉玲 張心怡 周勝?gòu)?qiáng) 劉 芳△

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410208；2.湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 410006）

缺血性腦卒中又稱中風(fēng)，在卒中中有60%～80%為此類型。近年來(lái)調(diào)查顯示腦血管疾病已成為我國(guó)居民首位死因［1］。腦梗死急性期病情變化迅速，西醫(yī)主要以溶栓、抗血小板聚集等治療，但是大部分患者經(jīng)過(guò)急性期的治療后仍會(huì)留有因梗死而造成的神經(jīng)功能缺損癥狀，如失語(yǔ)、運(yùn)動(dòng)感覺(jué)障礙、情感障礙等［2］。恢復(fù)期則主要以康復(fù)及預(yù)防治療為主。前期研究表明，芪仙通絡(luò)方經(jīng)過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明能顯著促進(jìn)大腦中動(dòng)脈阻塞（MCAO）大鼠模型神經(jīng)功能恢復(fù)，促進(jìn)遠(yuǎn)隔損害部位丘腦及黑質(zhì)的軸突再生、促進(jìn)神經(jīng)元細(xì)胞突觸重塑的作用［3-5］。本研究通過(guò)建立MCAO模型，基于在體動(dòng)物水平，從少突膠質(zhì)前體細(xì)胞（OPC）、髓鞘堿性蛋白（MBP）表達(dá)等方面探究芪仙通絡(luò)方對(duì)MCAO大鼠是否具有促進(jìn)髓鞘再生的功能。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)SD大鼠40只購(gòu)于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司［動(dòng)物合格證：SCXK（湘）2009-0004］，雄性，月齡1～2月，體質(zhì)量（250±20）g，于湖南省中醫(yī)藥研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心［實(shí)驗(yàn)室許可證：SYXK（湘）2020-0008）］進(jìn)行分籠飼養(yǎng)，每籠5只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，實(shí)驗(yàn)室溫度（24±0.5）℃，相對(duì)濕度50%～60%，噪聲＜50 dB。

1.2 藥物與試劑 1）藥物：芪仙通絡(luò)方組成為黃芪30 g，枸杞子30 g，葛根30 g，丹參30 g，淫羊藿15 g，制首烏15 g，山楂15 g，水蛭9 g。飲片均由湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院中藥房提供，由藥劑科田其學(xué)主任藥師鑒定為正品。煎制中藥，以中火熬煮，時(shí)間依據(jù)高、中、低濃度不等，參照大鼠臨床等效劑量換算公式（按70 kg成人與動(dòng)物體質(zhì)量藥量進(jìn)行折算），推算出高中低劑量濃度所需藥液為55、110、220 mL，制備完畢后儲(chǔ)存于4℃冰箱內(nèi)備用。丁苯酞軟膠囊（石藥集團(tuán)恩必普藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20050299）。2）試劑：髓鞘染液（武漢賽維爾生物科技有限公司，貨號(hào)G1030-100ML）；MBP抗體（武漢賽維爾生物科技有限公司，貨號(hào)GB11226）；5-乙炔基-2'-脫氧尿苷（EDU）抗體（碧云天生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)ST076-250 mg）；EDU染色試劑盒（武漢賽維爾生物科技有限公司，貨號(hào)C10310）；少突膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子2（Olig2）Olig2抗體（武漢博士德生物工程有限公司）；FITC標(biāo)記的驢抗兔IgG（武漢賽維爾生物科技有限公司，貨號(hào)GB22403）；HRP標(biāo)記驢抗山羊IgG（武漢賽維爾生物科技有限公司，貨號(hào)GB23404）。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 石蠟包埋機(jī)（武漢俊杰電子有限公司，型號(hào)JB-P5），石蠟切片機(jī)（上海徠卡儀器有限公司，型號(hào)RM2016），組織攤片機(jī)（浙江金華科迪儀器設(shè)備有限公司，型號(hào)KD-P），病理切片機(jī)（上海徠卡儀器有限公司，型號(hào)RM2016），烤箱（上海慧泰儀器制造有限公司，DHG-9140A），正置光學(xué)顯微鏡（日本尼康，型號(hào)NIKON ECLIPSE C1），顯微鏡（日本尼康，型號(hào)NIKON E100），MACO線栓（北京西濃科技有限公司，貨號(hào)2838-A4）。

1.4 分組與造模 采用改良Longa線栓法復(fù)制并評(píng)價(jià)MCAO大鼠模型［6］。大鼠術(shù)前12 h禁食不禁水。10%水合氯醛按3.5 mL/kg腹腔注射麻醉，將大鼠仰臥位固定于手術(shù)操作臺(tái)上，取頸部正中切口，游離左側(cè)頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈，結(jié)扎頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈，于頸總動(dòng)脈分叉部下方0.4 cm處刺一小口，將直徑為0.28 mm的線栓插入頸內(nèi)動(dòng)脈，至線栓頭端至大腦中動(dòng)脈開(kāi)口處，從而阻斷大腦中動(dòng)脈。插入深度由分叉部計(jì)為約18 mm，固定線栓，依次關(guān)閉切口。假手術(shù)組僅結(jié)扎左側(cè)頸總動(dòng)脈，不導(dǎo)入線栓，其余步驟和手術(shù)組相同。大鼠術(shù)后24 h，采用Longa評(píng)分法評(píng)定神經(jīng)功能，分值在1～3分者入組，死亡鼠予以隨機(jī)替補(bǔ)。取造模成功的大鼠，按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為模型組、芪仙通絡(luò)方組高劑量組、芪仙通絡(luò)方中劑量組、芪仙通絡(luò)方低劑量組、丁苯酞組，另設(shè)假手術(shù)組，共6組，每組各6只，總共36只。

1.5 干預(yù)方法 手術(shù)后第3天至14天，每日按照每1 mL/100 g給藥體積，芪仙通絡(luò)方高劑量組以31.32 g/（kg·d）灌胃，芪仙通絡(luò)方中劑量組以15.66 g/（kg·d）灌胃，芪仙通絡(luò)方低劑量組以7.83 g/（kg·d）灌胃，丁苯酞組用食用油配備后以0.054 g/（kg·d）灌胃。假手術(shù)組和模型組灌以同等劑量生理鹽水及等容積食用油，芪仙通絡(luò)方各劑量組還用等容積食用油灌胃。

1.6 觀察指標(biāo) 1）神經(jīng)功能缺損評(píng)價(jià)：于造模后3、7、14 d分別進(jìn)行mNSS評(píng)分，以評(píng)價(jià)MCAO大鼠神經(jīng)功能缺損情況。此評(píng)分表從運(yùn)動(dòng)功能、感覺(jué)功能、平衡能力和生理反射對(duì)大鼠各項(xiàng)功能進(jìn)行等級(jí)評(píng)分，總記18分，評(píng)分越高提示神經(jīng)功能缺失越嚴(yán)重。2）LFB染色觀察髓鞘結(jié)構(gòu)：大腦中動(dòng)脈梗死后14 d取材，將石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，切片入60℃0.1%固藍(lán)加膜加蓋浸染1 h，取出切片快速自來(lái)水洗。切片浸入碳酸鋰分化液中稍分化2 s，直接浸入70%乙醇分化15 s，水洗終止分化后鏡檢，至髓鞘呈藍(lán)色背景近無(wú)色；切片入65℃烤箱烤干拿出，冷卻后進(jìn)入95%乙醇后復(fù)染伊紅。最后將切片依次放入無(wú)水乙醇過(guò)3次，各5 min，后置二甲苯2次，每次5 min至透明，中性樹(shù)膠封片。每張切片隨機(jī)選取5個(gè)缺血側(cè)視野拍照采集圖像，采用Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件計(jì)算髓鞘表達(dá)的平均光密度（MOD值），進(jìn)行相對(duì)定量分析。3）免疫熒光雙標(biāo)檢測(cè)髓鞘再生數(shù)量：大腦中動(dòng)脈梗死后14 d取材，將EDU標(biāo)記的腦組織常規(guī)脫蠟至水，EDTA（pH8.0）抗原修復(fù)23 min，2 mol/L鹽酸37℃孵育30 min，0.1 mol/L硼酸漂洗10 min，3%BSA室溫封閉30 min；分別加入EDU抗體及Olig2抗體（1∶100），4℃孵育；第2天室溫復(fù)溫30 min，PBS洗3次，每次5 min，分別滴加FITC標(biāo)記的驢抗兔IgG（1∶100），室溫避光孵1 h；PBS洗5 min，重復(fù)3次，滴加DAPI染色液復(fù)染細(xì)胞核；PBS洗5 min，反復(fù)3次，最后加入抗熒光衰減封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察。每張切片隨機(jī)選取5個(gè)缺血側(cè)視野拍照采集圖像，采用Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件計(jì)算單位面積內(nèi)EDU/Olig2雙標(biāo)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，取其平均值進(jìn)行定量分析。4）免疫組化檢測(cè)MBP蛋白表達(dá)：大腦中動(dòng)脈梗死后14 d取材，腦組織切片常規(guī)脫蠟至水，EDTA（pH 9.0）抗原修復(fù)20 min；在室溫下3%雙氧水內(nèi)避光孵育25 min，滴加3%BSA后室溫封閉30 min；加入MBP抗體（1∶300），4℃孵育；次日PBS洗3次，各5 min，滴加HRP標(biāo)記驢抗山羊IgG（1∶100），室溫孵育50 min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，脫水后中性樹(shù)膠封片。光學(xué)顯微鏡下觀察，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)缺血側(cè)視野拍照采集圖像，采用Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件計(jì)算MBP蛋白表達(dá)的平均光密度（MOD值），進(jìn)行相對(duì)定量分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS26.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（）表示，神經(jīng)功能評(píng)分以重復(fù)測(cè)量方差進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，成對(duì)比較；LFB染色，熒光雙標(biāo)、免疫組化使用單因素方差進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，LSD法多重比較。P＜0.05為差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分 見(jiàn)表1。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠在第3、7、14日的神經(jīng)功能評(píng)分顯著上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較，芪仙通絡(luò)方低、中、高劑量組及丁苯酞組第7、14日神經(jīng)功能評(píng)分明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與低、中劑量組和丁苯酞組比較，高劑量組第7、14 d神經(jīng)功能評(píng)分顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分比較（分，±s）

表1 各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分比較（分，±s）

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與芪仙通絡(luò)方低劑量組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；與芪仙通絡(luò)方中劑量組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與丁苯酞組比較，&P＜0.05，&&P＜0.01。下同。

組 別n 第3日 第7日 第14日6 6 6 6 6 6假手術(shù)組模型組芪仙通絡(luò)方低劑量組芪仙通絡(luò)方中劑量組芪仙通絡(luò)方高劑量組丁苯酞組0.00±0.00 9.83±0.75*9.83±1.17 9.83±1.17 10.50±1.05 10.33±0.82 0.00±0.00 8.83±0.75*7.67±0.52△7.33±1.03△6.33±0.52△▲#&7.47±0.52△0.00±0.00 7.83±0.75*6.50±0.55△5.83±0.75△4.17±0.41△▲#&6.00±0.63△

2.2 各組大鼠缺血側(cè)髓鞘表達(dá)值比較 見(jiàn)表2，圖1。神經(jīng)髓鞘呈藍(lán)色，背景為淺藍(lán)色或近乎無(wú)色。假手術(shù)組髓鞘完整，LFB染色較為均與且排列緊致，模型組完整髓鞘數(shù)量明顯降低（P＜0.01）；與模型組比較，芪仙通絡(luò)方各劑量組和丁苯酞組髓鞘損傷情況均減輕，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；在所有給藥組中，高劑量組髓鞘表達(dá)相對(duì)最為完整且染色較均勻（P＜0.05）。

表2 各組大鼠缺血側(cè)髓鞘、Edu/Olig2陽(yáng)性、MBP蛋白表達(dá)比較（±s）

表2 各組大鼠缺血側(cè)髓鞘、Edu/Olig2陽(yáng)性、MBP蛋白表達(dá)比較（±s）

組別假手術(shù)組模型組芪仙通絡(luò)方低劑量組芪仙通絡(luò)方中劑量組芪仙通絡(luò)方高劑量組丁苯酞組n 6 6 6 6 6 6髓鞘0.253±0.083 0.097±0.010*0.176±0.006△0.202±0.010△0.302±0.056△▲#&0.189±0.018△Edu/Olig2陽(yáng)性51.667±9.074 51.667±4.000 103.667±7.095△△160.333±2.517△△190.000±9.644△△▲▲##&&150.000±7.937△△MBP蛋白0.089±0.001 0.050±0.005**0.070±0.005△△0.082±0.003△△0.099±0.003△△▲▲##&&0.080±0.001△△

圖1 各組大鼠缺血側(cè)髓鞘病理改變（LFB染色，200倍）

2.3 各組大鼠缺血側(cè)Edu/Olig2陽(yáng)性表達(dá)比較 見(jiàn)表2，圖2。免疫熒光雙標(biāo)表達(dá)DAPI染色為藍(lán)色，EDU陽(yáng)性表達(dá)綠色，Olig2陽(yáng)性表達(dá)為紅色。在模型組中可見(jiàn)少量EDU/Olig2雙標(biāo)陽(yáng)性細(xì)胞，與假手術(shù)組比較，模型組EDU/Olig2雙標(biāo)陽(yáng)性表達(dá)相似，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與模型組比較，各給藥組EDU/Olig2雙標(biāo)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目顯著增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；其中以高劑量組雙標(biāo)陽(yáng)性細(xì)胞增加最為顯著，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

圖2 各組大鼠缺血側(cè)Edu/Olig2陽(yáng)性表達(dá)比較（免疫熒光染色，200倍）

2.4 各組大鼠缺血側(cè)MBP蛋白表達(dá)比較 見(jiàn)表2，圖3。DAB顯出的陽(yáng)性表達(dá)為棕黃色，蘇木素染細(xì)胞核為藍(lán)色。假手術(shù)組可見(jiàn)大量MBP蛋白表達(dá)，模型組MBP蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，芪仙通絡(luò)方各劑量組和丁苯酞組MBP蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.01）；與芪仙通絡(luò)方低、中劑量組和丁苯酞組比較，高劑量組MBP蛋白表達(dá)升高最明顯（P＜0.01）。

圖3 各組大鼠缺血側(cè)MBP陽(yáng)性表達(dá)比較（免疫組化，200倍）

3 討 論

缺血性腦卒中的主要表現(xiàn)是白質(zhì)損傷，無(wú)論是小血管梗死或大的顱內(nèi)動(dòng)脈梗死均可造成白質(zhì)損傷［7-8］。且越來(lái)越多的研究表明，缺血性中風(fēng)患者的腦白質(zhì)病變與不良預(yù)后獨(dú)立相關(guān)［9］，軸突上的髓鞘被破壞至消失的過(guò)程成為沃勒變性，這一過(guò)程為腦白質(zhì)病變的主要病理基礎(chǔ)［10-11］。故抑制髓鞘變性及促進(jìn)髓鞘再生對(duì)于腦梗死后的治療尤為重要。少突膠質(zhì)細(xì)胞重新包裹髓鞘，并且軸突恢復(fù)生理功能的過(guò)程稱為髓鞘再生［12］，但髓鞘再生的過(guò)程需要OPC先增殖并遷移到需要軸突髓鞘形成的區(qū)域，再逐漸向成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞分化［13］。由此可見(jiàn)OPC在髓鞘再生過(guò)程至關(guān)重要。Olig2是OPCs增殖及分化過(guò)程中的重要轉(zhuǎn)錄因子，OPCs分化為少突膠質(zhì)細(xì)胞的過(guò)程需要Olig2參與［14］，有研究顯示，OPCs在Olig2基因缺失的脫髓鞘模型大鼠脊髓中明顯減少［15］。MBP是成熟的少突膠質(zhì)細(xì)胞分泌的一種促進(jìn)髓鞘形成及再生的堿性蛋白［16］。大量實(shí)驗(yàn)表明MBP與髓鞘化水平相關(guān)，MBP表達(dá)增加時(shí)提示髓鞘處于形成或再生過(guò)程，相反則可提示髓鞘損傷或髓鞘形成欠佳［17-18］。

本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)模型組Olig2下調(diào)，提示髓鞘再生受到阻礙，而芪仙通絡(luò)方各組較模型組Olig2明顯上調(diào)，提示中動(dòng)脈阻塞髓鞘損傷后，芪仙通絡(luò)方組能促進(jìn)OPCs分化為成熟的少突膠質(zhì)細(xì)胞而推動(dòng)髓鞘再生。其中芪仙通絡(luò)方高劑量組（31.32 g/kg）最為明顯。本實(shí)驗(yàn)研究表明模型組大鼠腦組織MBP蛋白表達(dá)受到抑制，芪仙通絡(luò)方組MCAO大鼠腦組織MBP表達(dá)上調(diào)，顯示芪仙通絡(luò)方在31.32 g/kg劑量時(shí)表達(dá)最高，表明芪仙通絡(luò)方為其促進(jìn)髓鞘修復(fù)和再生提供了有利條件，且具有濃度依賴性。

現(xiàn)代醫(yī)家將中風(fēng)的病機(jī)歸納為本虛標(biāo)實(shí)，肝腎陰虛，氣血衰少為本，導(dǎo)致內(nèi)生風(fēng)、火、痰、氣、瘀，標(biāo)本互結(jié)，最后導(dǎo)致氣機(jī)逆亂致腦絡(luò)閉阻，腦髓失養(yǎng)，神明受損［19］。國(guó)醫(yī)大師劉祖貽教授認(rèn)為腦梗死后神經(jīng)功能缺損的基本病機(jī)為“腎虛血瘀”，其致病之本為腎精虧虛、髓海不足為本，標(biāo)為瘀血阻絡(luò)，劉老認(rèn)為腎腦相關(guān)，若想腎精轉(zhuǎn)化為腦髓，需腎中陽(yáng)氣溫煦推動(dòng)腎中陰精，陰陽(yáng)二氣相互激蕩，方可化髓充腦。據(jù)此，劉老提出“腦髓陽(yáng)生陰長(zhǎng)”理論并創(chuàng)制效驗(yàn)方——芪仙通絡(luò)方。方用黃芪大補(bǔ)元?dú)猓蜣綔啬I陽(yáng)，枸杞子、制首烏益腎填精，水蛭、丹參等活血化瘀為助。通過(guò)臨證反復(fù)實(shí)踐，該方能在保證較好的安全性下使中風(fēng)患者的神經(jīng)功能缺損癥狀得到良好的改善［3］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，芪仙通絡(luò)方無(wú)論藥物濃度高低均可顯著改善MCAO大鼠神經(jīng)功能評(píng)分，促進(jìn)其神經(jīng)功能恢復(fù)，促進(jìn)髓鞘的再生，其中又以高劑量作用最佳，說(shuō)明芪仙通絡(luò)方可以通過(guò)促進(jìn)MBP的表達(dá)，Olig2的分化使再髓鞘化從而促進(jìn)神經(jīng)功能修復(fù)。

綜上所述，芪仙通絡(luò)方能改善腦梗死大鼠受損神經(jīng)功能，其機(jī)制可能與促進(jìn)缺血側(cè)OPCs遷移、分化及MBP蛋白表達(dá)而促進(jìn)髓鞘再生有關(guān)，其中以高劑量組作用最佳。