葛根素對妊娠期糖尿病大鼠的治療效果及作用機制的研究*

楊根嶺 胡榮靜 李金艷△

（1.重慶醫科大學，重慶 400016；2.重慶市中醫院，重慶 400021）

妊娠期糖尿病（GDM）是一種常見妊娠期并發癥［1］，GDM時妊娠不良結局增加［2］。胰島素治療GDM時會引起胰島素敏感性降低［3］。細胞攝取葡萄糖是維持正常血糖的關鍵步驟，膜蛋白（GLUT）轉運葡萄糖到細胞質是完成胰島素信號通路的最終步驟［4］。葛根素（Puerarin）是從葛根中提取出的最主要異黃酮類物質［5］，能改善高血糖導致的機體發生的病理改變，具有良好的降糖效果［6］。許多口服降糖藥物對胎兒有致畸作用［7］。目前，國外尚未開展葛根素治療GDM方面的研究，國內有少數學者將葛根素應用于臨床治療GDM。該試驗研究葛根素對GDM的降糖效果，并探討葛根素在治療GDM時的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 PF級SD大鼠雌性50只，雄性20只，購于重慶醫科大學實驗動物中心，許可證號：SCXK（渝）2018-0003。

1.2 試藥與儀器 葛根素注射液，購自山東方明藥業集團股份有限公司，批號20111071，規格為0.1 g/支。儀器：光學顯微鏡（日本Nikon公司），歐姆龍HEA-214血糖儀，酶標儀（ThermoFisher）。

1.3 模型制備 SD大鼠尾靜脈采血測定雌鼠空腹血糖，若血糖大于7.1 mmol/L，予以剔除。動物合籠，次日陰道涂片確定妊娠后按35 mg/kg腹腔注射2%鏈脲菌素（STZ）。檢測血糖≥13.8 mmol/L視妊娠期糖尿病SD大鼠造模成功。

1.4 分組與給藥 將成模大鼠隨機分為葛根素組與糖尿病組，正常妊娠SD大鼠作為對照（正常妊娠組），每組各10只。建模成功后4～20 d，葛根素組每天給予150 mg/kg葛根素灌胃治療［8］，糖尿病組與正常妊娠組灌胃等量生理鹽水。

1.5 觀察指標 每天檢測孕鼠的血糖，妊娠1、11、20 d測體質量，妊娠20 d剖宮取胎鼠，記錄胎鼠的數量、畸形發生數。

1.6 標本采集與檢測 1）胰島素及血脂水平檢測。在20 d眶靜脈采血，經離心后收集血漿。采用ELISA試劑盒檢測血漿胰島素水平。BS800-2邁瑞全自動生化分析儀測定血清中高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）、總膽固醇（TC）、三酰甘油（TAG）的含量。2）胰島素病理學觀察。HE染色：在G20.5乙醚麻醉下行剖宮產術，取孕鼠胰腺組織經4%多聚甲醛固定，石蠟包埋切片。胰腺組織切片經脫蠟、覆水、蘇木精染色、返藍、鹽酸酒精分化、伊紅復染、脫水、透明、封片，鏡檢。3）胰腺GLUT-4蛋白表達。胰腺組織切片經脫蠟復水，抗原修復，去除內源性過氧化氫酶，血清封閉，加GLUT-4（濃度為1∶100）過夜，加抗兔生物素化二抗，顯色。蘇木素復染，鹽酸酒精分化，飽和碳酸鋰返藍，脫水、透明、封片、鏡檢。4）Western blotting檢測GLUT-4蛋白表達。提取胰腺組織蛋白，經電泳分離、電轉至PVDF膜、封閉PVDF膜、分別孵育GLUT-4、β-actin一抗（1∶1 000）4℃過夜，孵育二抗，Bio-Rad凝膠成像系統軟件成像及分析目的條帶和內參條帶的灰度值。

1.7 統計學處理 應用SPSS17.0統計軟件。數據以（）表示，多組間樣本均數比較采用單因素方差分析，兩兩比較用LSD檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組孕鼠隨機血糖水平比較 見表1。糖尿病組與葛根素組孕鼠的血糖顯著高于正常妊娠組，有顯著統計學意義（P＜0.05）。葛根素不能將孕鼠的血糖完全降至正常，但隨著給藥時間的延長，降糖效果逐漸明顯，在7 d后葛根素組血糖明顯低于糖尿病組（P＜0.05）。

表1 各組孕鼠隨機血糖水平比較（mmol/L，±s）

表1 各組孕鼠隨機血糖水平比較（mmol/L，±s）

注：與糖尿病組比較，*P＜0.05；與正常妊娠組比較，△P＜0.05。下同。

組別正常妊娠組糖尿病組葛根素組n 10 10 10 1 d 4.30±0.60 4.61±0.58 4.80±0.41 4d 4.50±0.70 26.23±2.83△27.50±3.03△7d 4.40±0.90 27.62±3.66△24.30±5.36*△10d 4.60±0.80 26.82±4.59△18.42±4.72*△13d 4.80±0.60 28.43±5.61△15.48±5.26*△16d 4.90±0.80 31.52±3.68△13.20±4.96*△19d 5.20±0.80 32.96±3.97△10.83±3.76*△

2.2 各組孕鼠血脂和胰島素水平比較 見表2。與正常妊娠組比較，糖尿病組孕鼠的胰島素水平下降、血脂顯著增加（P＜0.05），給予葛根素治療后，胰島素水平顯著增加、血脂水平顯著降低，葛根素組與糖尿病組比較差異顯著（P＜0.05）。葛根素組的胰島素水平較糖尿病組顯著升高，但顯著低于正常妊娠組（P＜0.05），血脂水平顯著低于正常妊娠組（P＜0.05）。

表2 兩組各組孕鼠血脂和胰島素水平比較（±s）

表2 兩組各組孕鼠血脂和胰島素水平比較（±s）

組 別n TC（mmol/L）TAG（mmol/L）HDL（mmol/L）LDL（mmol/L）INS（mU/L）10 10 10正常妊娠組糖尿病組葛根素組1.91±0.42 5.43±1.56△3.32±1.25*△0.86±0.25 3.86±0.91△2.33±0.32*△2.48±0.43 5.01±0.81△3.25±0.57*△0.36±0.12 1.86±0.49△0.68±0.31*△16.38±3.16 9.36±1.48△13.20±4.52*△

2.3 各組孕鼠不同妊娠天數體質量比較 見表3。隨著孕周的增加各組大鼠體質量均呈上升趨勢。與正常妊娠組孕中期（11 d）與孕晚期（20 d）體質量相比較，糖尿病組孕鼠體質量均顯著增加（P＜0.05）；葛根素組孕鼠體質量均無顯著差異（P＞0.05）。與糖尿病組孕中期（11 d）與孕晚期（20 d）孕鼠體質量相比較，葛根素組體質量顯著降低（P＜0.05）。

表3 各組孕鼠不同妊娠天數體質量比較（g，±s）

表3 各組孕鼠不同妊娠天數體質量比較（g，±s）

組 別n 妊娠1 d 妊娠11 d 妊娠20 d 234.1±12.3 236.6±13.2 230.1±18.4正常妊娠組糖尿病組葛根素組10 10 10 246.3±16.8 274.6±18.6△255.3±19.4*296.9±22.3 355.8±24.6△319.6±16.2*

2.4 各組胎仔數、胎鼠體質量、胎鼠血糖的比較 見表4。各組胎鼠均未發現有畸形發生。與正常妊娠組比較，糖尿病組與葛根素組胎仔數量顯著減少，胎鼠體質量與血糖水平顯著增加（P＜0.05）。與糖尿病組比較，葛根素組胎仔數顯著增加，胎鼠體質量顯著增加，胎鼠血糖顯著降低（P＜0.05）。

表4 各組胎仔數、胎鼠體質量及血糖比較（±s）

表4 各組胎仔數、胎鼠體質量及血糖比較（±s）

組別正常妊娠組糖尿病組葛根素組n 10 10 10胎仔數（個）12.70±1.49 8.10±1.96△10.80±2.56*體質量（g）1.92±0.25 2.94±0.41△2.23±0.37*隨機血糖（mmol/L）3.84±1.53 29.57±1.49△12.83±4.23*△

2.5 各組孕鼠胰腺組織病理學觀察 正常妊娠組孕鼠胰腺胰島形態結構正常，胰島內的胰島細胞排列均勻。糖尿病組胰島萎縮，數量減少，體積變小，形狀不規則，胰島細胞呈蟲噬狀。葛根素組胰島數量和體積均明顯恢復，胰島內胰島細胞增多、纖維組織減少。見圖1。

2.6 各組孕鼠胰腺組織GLUT-4免疫組化表達比較 GLUT-4主要表達在胰腺的胰島內。鏡下觀察到，糖尿病組僅有少量的胰島細胞染色為棕黃色，GLUT-4表達明顯減少，低于正常妊娠組；經葛根素治療后，胰島的GLUT-4的表達明顯增加，高于模型組。見圖2。

2.7 各組孕鼠胰腺組織GLUT-4的表達水平 經Western blotting檢測糖尿病組胰腺組織中GLUT-4蛋白相對表達量明顯低于正常妊娠組（P＜0.05），葛根素組表達量明顯升高，但仍然低于正常妊娠組（P＜0.05）。見圖3。

圖3 各組GLUT-4蛋白在胰腺組織的表達

3 討 論

GDM是產科常見的并發癥，在妊娠晚期容易出現急性羊水過多、胎盤早剝等急癥［9］；新生兒容易出現呼吸窘迫綜合征、死亡等急癥。盡管胰島素是治療GDM的一線藥物，但易出現低血糖等急癥。中藥在治療許多疾病上有獨特的作用［10］，為更好治療妊娠期糖尿病，提高母兒預后，本研究重點研究葛根素應用于治療GDM的效果及作用機制。

葛根素是天然異黃酮，現代醫藥已將其用于治療糖尿病［6］。葛根素能改善高血糖導致的機體發生的病理改變，能促進處于高糖環境的前脂肪細胞對葡萄糖的攝取并呈劑量依賴性［11］。國內部分學者應用葛根素治療GDM，降糖效果理想［12］，安全性高［13］，能降低胎兒臍動脈S/D值［14］，降低新生兒生長受限等并發癥［15］。

妊娠時激素水平升高，胰島素敏感性下降，出現胰島素抵抗，導致GDM發生［16］。葛根素具有抗糖尿病的特性。葛根素能降低STZ誘導后小鼠糖尿病的發生，同時增加胰島β細胞的數量，進一步增加胰島素水平，降低血糖［17］。本研究發現GDM大鼠胰島受到破壞后，胰島素的生成急劇降低，而使用葛根素治療后胰腺的胰島細胞得以修復，胰島細胞數量增加，胰島體積變大，胰島內纖維化明顯緩解。葛根素對破壞的胰島具有保護作用，并能進一步促進胰島分泌胰島素，該結果與國內外研究葛根素在治療糖尿病時對胰島的作用是一致的。同時研究發現葛根素在治療GDM時，不能將胰島素、血糖、血脂水平恢復至完全正常，但葛根素治療GDM時能降低孕鼠及胎鼠的血糖水平，并能有效阻止血脂的升高，降低血脂水平，改善GDM孕鼠的代謝能力，能減少孕鼠和胎鼠體質量的增加，將孕鼠及胎鼠體重恢復至正常。同時葛根素能減少孕鼠的流產率，增加胎仔數，推測葛根素在胚胎著床時具有較強的保護作用。

GLUT有多種亞型，其中GLUT-1、GLUT-4對葡萄糖轉運尤為重要［18］。GLUT-4在脂肪組織、心肌和胎盤組織中均有表達［19］。90%GLUT4位于細胞內；血糖增高時，GLUT4儲存囊泡吸收葡萄糖向質膜、骨骼肌細胞的肌膜和T管進行胞吐，參與葡萄糖轉運功能［4］。提高GLUT-4表達和刺激GLUT-4囊泡向質膜轉運能促進葡萄糖轉運［20］。本研究顯示GLUT-4蛋白水平在GDM患者胰腺組織中明顯減少，可能導致葡萄糖的攝取和利用出現障礙，進而不能維持正常的血糖水平；而使用葛根素治療后GLUT-4蛋白的表達顯著提高，表明其能促進葡萄糖的攝取和利用，具有降糖的作用。

該研究表明在治療GDM時，葛根素對胰腺β細胞具有保護作用能恢復胰島的數量，促進胰島素的分泌；促進胰島上GLUT-4的表達，促進葡萄糖的攝取和利用，從而降低血糖水平。葛根素能減少流產的發生，降低孕鼠及胎鼠的體質量，改善妊娠的結局。因葛根素不能將GDM血糖降至完全正常，但是其具有保護胰腺、促進胰島素分泌作用，在治療GDM時加用葛根素能取得更好的臨床治療效果。該課題為葛根素的使用提供實驗室依據并能更好地指導中醫師使用葛根素治療臨床疾病，開發葛根素臨床治療的新領域。