養心湯對同型半胱氨酸致大鼠血管內皮功能障礙的影響*

皇甫海全 畢尚青 于海睿

（廣州中醫藥大學附屬寶安中醫院，廣東 深圳 518133）

血管內皮功能障礙是動脈粥樣硬化（AS）形成的始動因素，是多種血管疾病的病理基礎［1］。生理狀態下血管內皮能夠維持血管壁完整性與通透性，調節血管張力及凝血纖溶系統平衡，參與細胞黏附增殖、代謝、自噬、凋亡等過程。而氧化應激損傷［2］、炎癥反應損傷［3］、高血壓［4］、高血糖［5］、高血脂［6］、缺血/再灌注損傷［7］、高剪切力等因素均可導致血管內皮功能障礙甚至內皮損傷，激活炎癥反應，加速血管壁脂質沉積并向內膜下遷移，最終形成AS。因此，改善血管內皮功能，減輕內皮損傷，一定程度上可延緩AS的進程。前期基礎研究證實，中藥養心湯可降低不穩定型心絞痛模型家兔頸總動脈內中膜厚度、搏動指數及阻力指數［8］；上調心肌缺血家兔模型血清一氧化氮（NO）及一氧化氮合酶（NOS）水平［9］；降低p53基因轉染易損斑塊家兔模型血漿巨噬細胞移動抑制因子（MIF）、白細胞介素-18（IL-18）、基質金屬蛋白酶-9（MMP-9）的水平［10］，發揮抗動脈粥樣硬化的作用?；谇捌谘芯炕A及血管內皮功能障礙動脈粥樣硬化學說，本研究擬建立血管內皮功能障礙模型，應用養心湯進行干預，觀察其對血管內皮功能障礙的影響，并對相關機制進行探討，旨在進一步明確養心湯抗動脈粥樣硬化的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 6周齡雄性SD大鼠，40只，體質量180～220 g，購于實驗動物中心（合格證號：SCXK-2013-004），飼養條件：溫度18～22℃，濕度45%～55%、風速0.1～0.2 m/s，24 h自由攝水，12 h明暗循環照明。

1.2 試藥與儀器 養心湯藥物組成包括炙黃芪、黨參、茯神、茯苓、五味子、清半夏、川芎、遠志、炒酸棗仁、柏子仁、肉桂、當歸、炙甘草13味中藥。取養心湯生藥共485 g，加水煎煮2次，每次1.5 h，合并濾出液，將濾出液濃縮成相對濃度1.20（90℃）的浸膏270 g，冷卻至室溫，加入等量乙醇搖勻，靜置12 h，取上層清液，回收乙醇并濃縮成相對濃度1.25（80℃）的浸膏90 g，每克養心湯浸膏含有生藥5.39 g，由本院制劑室制備。葉酸片（天津力生制藥股份有限公司生產，國藥準字H12020215）。NO、內皮素-1（ET-1）、同型半胱氨酸（Hcy）、蛋白C受體（sEPCR）、可溶性血栓調節蛋白（sTM）試劑盒（上海信裕生物），3%戊二醛（北京索萊寶），Hcy（西安康諾化工），萊卡超薄切片機（德國LeicaEM UC7），透射電子顯微鏡（日立HT7800），超低溫冰箱（賽默飛902-ULTS），離心機（德國5415D）。

1.3 造模與分組 采用高蛋氨酸飼料喂養大鼠建立Hcy血管內皮功能障礙模型［11］。40只大鼠隨機分為空白組、模型對照組、葉酸組、養心湯組，每組10只?？瞻捉M喂養常規普通飼料，其余3組喂養含3%L-蛋氨酸的飼料，共喂養12周建立血管內皮功能障礙模型。根據預實驗結果，喂養12周后大鼠胸主動HE染色可見血管內皮不完整連續，血管內皮部分脫落，細胞缺失處內膜不光滑，有少許紅細胞、白細胞黏附（見圖1），表明內皮功能障礙大鼠模型建立成功。

圖1 大鼠胸主動脈血管內皮損傷（HE染色）

1.4 干預方法 于實驗第13周進行藥物干預，空白組、模型組灌胃等體積純凈水；葉酸組灌胃葉酸混懸液1.8 mg/（kg·d）；養心湯組灌胃養心湯浸膏混懸液2.34 g/（kg·d），灌胃4周。

1.5 標本采集與檢測 給藥結束后，大鼠麻醉稱重，腹主動脈采血，4℃，3 000 r/min，離心10 min，分離血清凍存待測；取血后，迅速剪開胸腔，沿大鼠脊柱小心分離整段主動脈，眼科手術剪刀去掉血管多余組織，取5 mm胸主動脈用3%戊二醛溶液固定，透射電鏡觀察胸主動脈血管內皮超微結構。ELISA法檢測血清NO、ET-1、Hcy、sEPCR、sTM水平，嚴格按照試劑盒說明書步驟進行。

1.6 統計學處理 應用SPSS19.0統計軟件。計量資料以（）表示，組間比較采用單因素方差分析，多重比較用LSD法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠一般狀態 模型建立期間40只大鼠未出現死亡，空白組大鼠一般狀況良好，毛色光滑、柔順，活動量正常，進食良好。其余3組大鼠表現為毛色暗黃，進食量、活動量減少。灌胃給藥期間養心湯組大鼠死亡1只，解剖后發現，為食物誤吸進入氣管導致死亡，大鼠總體死亡率為2.5%。灌胃后，養心湯組、葉酸組大鼠一般情況好轉，與模型組比較，毛發色澤改善，進食量、活動量增加，對外界刺激反應較靈敏。

2.2 各組大鼠血管內皮電鏡結果 見圖2～圖9?？瞻捉M可見血管內皮連續完整，表面光滑，內皮細胞呈梭形，單層緊密排列，染色質均勻，可見結構正常細胞器、內質網和線粒體，豐富的核糖體，內皮細胞下可見含有膠原纖維和彈力纖維的結締組織。模型組可見血管內皮大部分脫落，偶見殘存的內皮，內皮細胞腫脹向血管腔突起，細胞核不規則，細胞膜呈蟲蝕樣變，部分核孔擴張，異染色質大多聚集于核膜下，胞質內空泡明顯增多，粒體腫脹變性，部分平滑肌細胞向內皮下層遷移。葉酸組可見血管內皮部分腫脹，可見完整的內皮，內皮細胞腫脹，細胞質透亮，連接松散，線粒體腫脹，脊溶解、斷裂、消失，膠原纖維增多，平滑肌細胞層不連續。養心湯組可見血管內皮基本連續完好，內膜表面光滑，未見明顯突起，內皮細胞輕度變性，呈梭形，可見細胞核，內皮細胞下層的膠原纖維和彈力纖維結構基本完整。

圖2 空白組（7 000倍）

圖3 空白組（15 000倍）

圖4 模型組（7 000倍）

圖5 模型組（15 000倍）

圖6 葉酸組（7 000倍）

圖7 葉酸組（15 000倍）

圖8 養心組（7 000倍）

圖9 養心組（15 000倍）

2.3 各組大鼠血清NO、ET-1、Hcy、sEPCR、sTM水平比較 見表1。與空白組比較，模型對照組大鼠血清NO水平降低，ET-1、Hcy、sEPCR、sTM水平升高，差異具有統計學意義（P＜0.01）；與模型組比較，葉酸組、養心湯組大鼠血清NO水平升高，ET-1、Hcy、sEPCR、sTM水平降低，差異具有統計學意義（P＜0.01）。

表1 各組大鼠血清NO、ET-1、Hcy、EPCR、TM水平比較（±s）

表1 各組大鼠血清NO、ET-1、Hcy、EPCR、TM水平比較（±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05。

組別空白組模型組葉酸組養心湯組n 10 10 10 9 NO（μmol/L）14.66±1.15 8.70±0.82*13.12±0.49△13.04±0.65△ET-1（pg/mL）117.46±17.40 230.87±24.78*143.66±24.73△141.90±23.92△Hcy（μmol/L）1.73±0.19 4.09±0.23*2.14±0.18△2.18±0.22△sEPCR（pg/mL）214.09±16.41 430.96±22.74*342.10±18.86△329.01±23.42△sTM（pg/mL）57.91±11.15 107.82±13.33*72.60±10.95△69.21±12.48△

3 討論

有研究認為Hcy水平與冠脈狹窄程度的相關性僅次于高血脂、高血壓、吸煙等危險因素［12］。Hcy可以通過氧化應激反應、內質網應激、促進死亡受體表達等多種機制損傷血管內皮，破壞內皮的屏障作用，減少舒血管物質的釋放，增加縮血管物質的生成，導致血管張力增加順應性下降、血小板黏附、脂質沉積、炎癥反應，最終形成動脈粥樣硬化。大量的臨床試驗證實口服葉酸能降低Hcy濃度，改善血管內皮功能，抑制脂質過氧化，減少血管平滑肌增殖遷移，延緩動脈粥樣硬化的發生［13］。ET是目前已知的縮血管效應最強的活性多肽，ET-1主要由血管內皮細胞表達，具有促進血管平滑肌、心肌收縮及促進神經內分泌的功能，在維持心血管系統平衡穩定方面具有重要作用。NO是目前發現的舒張血管作用最強的物質［14］，具有抑制血管收縮及細胞增殖，并參與ET的清除作用，還具有減少血小板聚集和炎癥細胞黏附等功能［15］。血栓調節蛋白（TM）是內皮細胞膜表面的一種糖蛋白，具有維持凝血與纖溶之間平衡的作用［16］。通常情況下，TM與凝血酶結合形成凝血酶-TM復合物，并在Ca2+作用下激活蛋白C，進一步形成凝血酶-TM-蛋白C復合物（APC）。在蛋白S的作用下APC滅活因子Ⅴ、Ⅷ并抑制纖溶酶原激活抑制物，從而抑制纖維蛋白原的形成及血小板的聚集，預防血栓的形成［17］。當血管內皮受損或功能紊亂時，TM大量產生并釋放至循環血液中，進入循環中的TM能夠減輕血管炎癥和免疫過程中產生的細胞因子，發揮保護內皮細胞功能的作用，因此其血漿濃度升高可敏感反映各種原因的血管內皮細胞的損傷。內皮細胞蛋白C受體（EPCR）屬于一個多功能糖蛋白，選擇性地表達于大血管內皮細胞上，是近年發現的具有抗炎和抗凝作用的蛋白。當各種因素導致內皮細胞受損，血漿中EPCR濃度明顯升高，成為反映內皮細胞損傷的敏感指標，EPCR可作為血管內皮損傷的分子標記物?？扇苄匝軆绕ぜ毎鹲EPCR和sTM主要由血管內皮細胞分泌的一種糖蛋白，是蛋白C系統的主要組成部分，其通過參與蛋白激酶C等介導的信號系統調節凝血、纖溶及炎癥反應，維持血管內環境穩定［18］。因此sEPCR、sTM作為血管內皮損傷敏感而特異的分子標志物反映血管內皮細胞功能。本研究表明養心湯可增加大鼠血清的NO水平，減少ET-1、Hcy、sEPCR、sTM釋放，同時電鏡結果更加直觀地表明養心湯能夠減輕大鼠血管內皮損傷程度，改善血管內皮功能障礙，這可能是其抗動脈粥樣硬化的作用機制之一。

養心湯出自《證治準繩·類方·驚》，主治心虛血少、驚惕不寧，由黃芪、黨參、當歸、川芎等13味中藥組成，具有益氣養血、寧心安神功效，方中重用黃芪為君藥，性甘微溫，歸肺脾兩經，以補益心氣，使氣行血脈通暢，與黨參合用共奏大補元氣之功；臣藥半夏、茯苓、茯神、遠志健脾安神；柏子仁、酸棗仁、五味子養心神而斂心氣；佐藥為川芎、當歸行氣活血化瘀，使藥為炙甘草，益氣復脈，調和諸藥，與肉桂合用鼓舞心陽，全方共奏益氣活血、養心安神之功?，F代藥理研究認為黃芪通過上調eNOS表達，促進NO生成，促進血管內皮細胞增殖及整合素活性，抑制泡沫細胞形成及血管平滑肌細胞增殖［19］；當歸提取物阿魏酸可上調PGI2表達，下調TXA2表達，抗血小板聚集，改善高脂誘導的血管內皮細胞損傷［20］。川芎乙醇提取物可上調內皮細胞中eNOS mRNA表達，調控eNOS活性促進NO生成，發揮對內皮細胞的保護作用［21］。Hcy誘導血管內皮功能障礙大鼠的研究證實，養心湯可上調NO表達，抑制ET-1、Hcy、sEPCR、sTM表達，改善血管內皮功能障礙，進一步闡釋了養心湯發揮抗動脈粥樣硬化的作用機制與保護血管內皮、調節內皮相關分子、維持內環境穩定相關。