外泌體在肝臟損傷中的研究進展

王子明，王 華,2,3

(1.安徽醫科大學第一附屬醫院腫瘤科，2.安徽醫科大學藥學院，肝病研究所，3.炎癥免疫性疾病安徽省實驗室，安徽 合肥 230032)

在多細胞生物中，體內穩態的維持需要不同功能的細胞相互作用與協調，而機體在面對不同的應激和損傷時也需要細胞間的通訊來應答。研究發現[1]，細胞不僅能夠通過直接接觸和分泌各種激素、細胞因子等化學信號傳遞信息，而且還能通過膜衍生的納米級的細胞外囊泡進行交流，外泌體作為細胞外囊泡的一種類型，攜帶著大量的蛋白質、核酸、脂質和代謝產物等，在細胞間和器官間的信息傳遞中有著不可或缺的作用。

各種類型肝損傷的發病機制目前尚不完全清楚，外泌體作為細胞間通訊的新介質，能夠在肝臟受到損傷時持續分泌，其攜帶的生物信息可以傳遞給鄰近或者遠距離細胞，從而引發受體細胞相關功能的改變，在多種類型肝損傷的發生發展中扮演著不同的角色。本文就外泌體在不同類型肝損傷中發揮的潛在作用予以綜述。

1 外泌體的產生、釋放與作用方式

外泌體是由細胞分泌的直徑約為40～160 nm的磷脂雙分子層結構，其產生與釋放包括內體分選轉運復合體(endosomal sorting complex required for transport，ESCRT)依賴和非依賴兩種方式，ESCRT由4種可溶性多蛋白復合物組成，包括ESCRT-0、ESCRT-Ⅰ、ESCRT-Ⅱ和ESCRT-Ⅲ，參與了蛋白質的分選以及外泌體的裝載等，是進化上高度保守的過程[1-2]。

外泌體依賴于ESCRT的發生機制：首先在胞吞和細胞膜內陷的作用下，早期核內體形成，之后不斷成熟形成晚期核內體，晚期核內體將其限制膜的一部分向腔內萌發形成腔內囊泡(intraluminal vesicles，ILVs)，隨后ESCRT被招募到內體膜的胞質一側，將所選蛋白分選入ILVs，ILVs不斷累積并逐漸成熟，從而形成了多泡體(multivesicular bodies，MVBs)。隨后MVBs既可以與溶酶體融合被降解，也能夠與質膜融合，完成外泌體的胞外分泌[3-4]。脂質驅動可能在ESCRT非依賴機制中發揮作用，這其中研究較多的是神經酰胺，參與了ILVs的生成[1]。

外泌體通過多種方式與靶細胞相互作用[3,5]：(1)配受體相互識別激活細胞內信號。(2)靶細胞通過細胞膜融合吸收外泌體。(3)靶細胞通過內吞機制(吞噬作用、大胞飲作用或受體介導的內吞作用)內化外泌體。

2 外泌體與肝損傷

生理條件下的外泌體能夠持續分泌，而在應激或病理狀態下，外泌體的內容物可能發生定性和定量的變化[6]。肝損傷可由脂質、酒精、膽汁、藥物以及病毒等多種原因引起，不同類型肝損傷釋放的外泌體裝載不同的內容物，作用于受體細胞后產生不同的影響，從而推動或者延緩肝臟疾病的發生發展。近年來，微小RNA(microRNA，miRNA)，一種高度保守的非編碼小RNA，在各種疾病中的作用已被廣泛研究，miRNA是生物體內基因表達的關鍵調控因子，外泌體攜帶包括miRNA在內的豐富的核酸，可以通過翻譯阻滯或mRNA降解來抑制靶向mRNA的蛋白表達過程[7]。下文將重點介紹外泌體中的miRNA在各種類型肝損傷中的作用。

2.1 外泌體與非酒精性肝病非酒精性肝病包括單純的肝臟脂肪變性、非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)以及相關的肝硬化和肝細胞癌一系列疾病。NASH是非酒精性脂肪肝發展為肝硬化并最終進展為肝細胞癌的關鍵事件，炎癥的出現是NASH的特征之一。脂毒性的肝細胞能夠通過各種分子途徑誘發肝細胞應激，引發肝細胞損傷，從而激活炎性細胞并釋放炎癥因子，外泌體在肝細胞和炎癥細胞的這種交叉對話中起到媒介作用。研究發現，脂毒性的肝細胞能夠釋放攜帶有miR-192-5p的外泌體，作用于巨噬細胞后，通過調節Rictor/Akt/FoxO1信號通路促進巨噬細胞向M1型極化，并刺激促炎因子的釋放，從而推動了炎癥的進展[8]。另外，脂質還能夠抑制肝細胞中MVBs在溶酶體的降解，導致含有miR-122-5p的外泌體分泌增加，并激活巨噬細胞向M1型極化，促進了炎癥的發生與發展[9]。Hirsova等[6]研究發現，脂毒性肝細胞能夠釋放含有腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體的外泌體，作用于位于巨噬細胞上的死亡受體5(death receptor 5，DR5)，并以DR5依賴的方式激活NF-κB信號通路，從而促進白細胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)與白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)的釋放。這些研究都表明，外泌體作為載體，攜帶著脂毒性肝細胞發出的信號分子，誘導巨噬細胞的激活以及炎癥因子的釋放，推動了非酒精性肝病的炎癥進展，這部分解釋了NASH發生的潛在機制。

Fig 1 Roles of exosomes in liver injury

內質網參與調節脂代謝穩態，脂毒性物質(如飽和游離脂肪酸等)能夠誘發內質網應激，可能會導致NASH的發生與發展[10]。研究發現[11]，內質網應激誘導的脂肪細胞分泌的外泌體能夠通過醛酮還原酶家族1成員B7觸發NASH。另外，脂質誘導肝細胞發生內質網應激后，肌醇依賴性激酶1α通過X盒結合蛋白1促進神經酰胺的新生合成增加，介導肝細胞以ESCRT非依賴的方式釋放外泌體后招募單核細胞到達肝臟，推動了NASH的進程[10]。這也說明了內質網應激作為脂毒性亞細胞應激的突出類型，其能夠從外泌體的生物學過程解釋NASH的病理過程，有利于對疾病發生機制的全面理解。

另外，有趣的是，髓樣特異性IL-6能夠促進巨噬細胞和中性粒細胞釋放含有miR-223的外泌體，作用于肝細胞后，減少肝細胞中具有PDZ結合域的轉錄活化因子(transcriptional activator with PDZ-binding motif，TAZ)的表達，TAZ具有促纖維化的作用，抑制TAZ能夠延緩非酒精性肝病向NASH乃至肝纖維化的進展，從而為非酒精性肝病的治療提供了新思路[12]。NASH作為非酒精性肝病進展的關鍵事件，早期給予適當的干預，能夠明顯減少不良的預后，外泌體在這一事件的進展中發揮重要作用，將其作為治療靶點將具有良好的臨床前景。

此外，外泌體在非酒精性肝病中的作用不僅僅局限于推動疾病的進展，還充當了機體不同器官之間交流的媒介。研究發現[7]，脂肪變的肝細胞釋放的外泌體攜帶microRNA-1，能夠抑制血管穩態的調控因子，從而引起內皮炎癥的發生和動脈粥樣硬化的形成，推動了心血管疾病的發生發展。此研究揭示了肝源性外泌體在肝臟和血管系統之間的遠距離通訊中的重要作用。另外，Zhao等[13]研究發現，脂質超載后，肝細胞釋放富含let-7e-5p等miRNA的外泌體，作用于脂肪細胞后，導致脂肪重構，從而引起脂質在肝臟、脂肪等器官之間重新分布，這也說明了肝臟不僅僅是一個被動的異位沉積器官，而且能夠感知不同代謝狀態，并通過外泌體協調功能，以重塑脂肪組織，來適應脂肪超載引起的代謝變化。

2.2 外泌體與酒精性肝損傷最近，大量的研究證明了酒精性肝損傷中肝細胞釋放的外泌體介導了酒精性肝病(alcoholic liver disease，ALD)的炎癥進程。如蛋白質組學分析已表明酒精性肝損傷循環中的外泌體增加，并攜帶酒精相關特異性蛋白質，且循環外泌體中的熱休克蛋白90介導了巨噬細胞在肝臟的激活[14]。另外，酒精性肝細胞釋放富含線粒體雙鏈RNA的外泌體，通過刺激庫普弗細胞上的Toll樣受體3，促進了IL-1β的產生與分泌，激活的庫普弗細胞進一步招募γδT細胞并促進了白細胞介素-17A(interleukin-17A，IL-17A)的分泌，加速了炎癥的進展[15]。

另外，有研究對ALD中外泌體分泌的增多做出了部分解釋，通過慢性酒精消耗可以提高肝臟中miR-155的水平，從而抑制自噬過程中的mTOR通路，下調溶酶體相關膜蛋白的表達，破壞溶酶體的功能，自噬體與多泡體結合，并將其內容物釋放到細胞外，外泌體的分泌增加[16]，此研究也進一步表明，在ALD中，酒精可以阻斷自噬體和溶酶體融合并促進外泌體的分泌，自噬和外泌體的生物發生是兩個復雜的過程，而由于其部分共同的分子機制，使得miR-155能夠在自噬和外泌體分泌之間產生串擾作用，因此，自噬和外泌體分泌之間的相互作用與影響需要進一步研究。

目前，有關外泌體在ALD中的研究大多集中在炎癥，然而ALD也是一種代謝性疾病，外泌體在ALD的代謝過程中是否發揮作用，尚需進一步探索。另外，外泌體在體液中廣泛存在，且攜帶酒精相關特異性組分，也可作為診斷酒精性肝損傷的標志物，但其特異性與靈敏度尚需評價。

2.3 外泌體與膽汁淤積性肝損傷膽汁流動障礙和膽汁酸代謝紊亂是膽汁淤積性肝損傷的主要誘因，肝內膽汁酸的淤積激活炎癥反應，導致肝內膽管破壞以及肝細胞損傷，最終導致膽管炎、肝纖維化和潛在的肝硬化。膽管細胞分泌的外泌體在膽汁淤積性肝損傷的發生以及疾病的進展中扮演著重要角色。研究表明[17]，在膽汁淤積的情況下，膽管細胞上調了長鏈非編碼RNA H19(long non-coding RNA H19，lncRNA H19)的表達，由外泌體裝載并作用于肝細胞，在肝細胞中通過抑制啟動子活性和降低mRNA穩定性來抑制小異源二聚體伴侶受體的表達，從而導致了膽汁淤積性肝損傷的發生與發展。此外，外泌體介導的巨噬細胞的活化在膽汁淤積性肝損傷的炎癥進展中也起著關鍵性的作用，同樣在膽汁淤積的情況下，攜帶有lncRNA H19的外泌體被庫普弗細胞攝取后，誘導了炎癥因子的表達、單核細胞的趨化以及M1型巨噬細胞的極化，從而導致了肝臟的炎癥進展[18]。另外，肝星狀細胞的激活是促進慢性膽汁淤積性肝病進展的主要驅動力。有研究進一步表明，膽管細胞釋放的含lncRNA H19的外泌體能夠作用于肝星狀細胞，從而促進肝星狀細胞的活化和增殖，加速了膽汁淤積性肝纖維化的進程[19]。

2.4 外泌體與藥物性肝損傷目前普遍認為，藥物引起的肝細胞損傷可能是由免疫反應介導的，并且大多數延遲時間較長的特異型藥物性肝損傷是由適應性免疫攻擊引起的[20]。外泌體可能在肝臟對藥物的免疫應答中發揮作用。Ogese等[21]通過對藥物性肝損傷中肝源性外泌體內包裹的蛋白質進行表征，發現經藥物修飾后的蛋白可以通過外泌體從組織細胞轉移到免疫系統，最終以肽片段的形式呈遞至樹突狀細胞表面的人白細胞抗原分子，觸發抗原特異性T細胞反應，介導肝細胞的損傷。另外，在藥物性肝損傷當中，肝細胞來源的外泌體能夠被單核細胞吸收并傳遞miRNA，改變單核細胞轉錄組，對單核細胞進行免疫抑制，從而促進肝臟的免疫耐受，T細胞反應可能正是由于免疫耐受的喪失導致的[22]。另外，Yarana等[23]認為，化療藥物阿霉素處理后的肝源性外泌體中的4-羥基壬烯醛——阿霉素誘導的氧化應激過程中產生的毒性脂質過氧化物，能夠上調巨噬細胞抗氧化酶硫氧還蛋白1水平，并通過調節抗炎與促炎之間的平衡從而保護肝臟免受炎癥損傷，這也表明了并不是所有暴露于氧化應激條件下釋放的外泌體都是有害的，外泌體也是一種新型的氧化還原免疫應答介質，提高了我們對癌癥治療過程中先天免疫應答的認識。

2.5 外泌體與病毒性肝損傷外泌體在病毒性肝損傷中可能扮演著不同的角色。首先，被乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染后的肝細胞分泌的外泌體被證實具有免疫抑制功能[24]。另外，外泌體可以將干擾素誘導跨膜蛋白2轉運至樹突狀細胞，抑制干擾素α(interferon-α，IFN-α)的激活，并阻斷了外源性IFN-α的抗HBV治療效果[25]。其次，在丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)感染導致的病毒性肝損傷當中，被HCV感染的肝細胞分泌的外泌體中的miR-192通過上調肝星狀細胞中轉化生長因子β1的表達，刺激肝星狀細胞向肌成纖維細胞活化，推動了肝纖維化的進程[26]。

有趣的是，在病毒性肝損傷當中，外泌體不僅在加速病毒復制以及推動纖維化進程中發揮作用，還可以通過干擾素抑制病毒復制從而介導抗病毒反應。巨噬細胞來源的含有hsa-miR-574-5p的外泌體能夠抑制肝細胞中HBV的復制和轉錄[27]。Zhao等[28]的研究發現，HBV感染的肝細胞衍生的外泌體含有HBV編碼的miRNA，即HBV-miR-3，下調了巨噬細胞中細胞因子信號轉導抑制因子的表達，從而激活JAK/STAT信號通路，增強了干擾素介導的抗病毒反應，并且巨噬細胞向M1表型極化，IL-6分泌增加，減輕了病毒性肝損傷。

外泌體對病毒性肝損傷的影響是多方面的，其可以清除病毒復制的不利因素，加速纖維化進程，也能夠通過細胞間通訊的作用激活先天免疫應答來抑制病毒復制，因此，外泌體在病毒性肝損傷當中的作用是復雜的，尚需進一步的研究與探討。

3 結論

外泌體中含有蛋白質、核酸、脂質等多種生物大分子，其介導的細胞通訊作用在機體中可能扮演著不同的角色，不同類型的細胞可以在生理條件下通過外泌體維持機體穩態，也能夠通過激活受體細胞的不同通路改變其功能，進而保護肝臟免受損傷或導致各種類型肝臟疾病的發生發展，因此，外泌體在不同條件下功能的復雜性需要進一步研究。另外，病理生理條件下的肝源性外泌體的作用不僅僅局限于肝臟的內環境，還可以通過遠距離的通訊影響其他組織器官，所以，外泌體對機體的影響是廣泛而深遠的。同時，在循環和肝臟中存在的特異性外泌體又使得其在肝損傷的診斷、治療和預后等方面具有較好的臨床前景，可作為肝損傷新型的治療載體、免疫調節劑等。外泌體的研究與應用也不僅僅局限于肝臟疾病，同時為許多疾病的診斷和治療提供了新的方法和策略。但是，外泌體的分離純化等技術尚需簡化和優化，雖然許多新的方法已經開發，但是尚未進行有力的評價，未來對于外泌體介導的疾病發生的具體機制也要進一步研究。