馬錢苷與黃連素聯合用藥對糖尿病小鼠骨代謝的影響

戴 璇，葉紫夢瑋，劉亞鴿 ，陳貝貝，朱如愿，夏兵可，張 浩，王新祥，王麗麗，張東偉

(北京中醫藥大學1.中醫學院糖尿病研究中心，北京 100029，2.東方醫院醫學實驗中心，北京 100078，3.中藥學院中藥藥理系，北京 100029)

隨著經濟的發展和人類生活方式的轉變，肥胖和超重人群逐漸增加，肥胖相關疾病已成為世界性的公共衛生問題。研究顯示，肥胖會影響胰島素敏感性，從而導致2型糖尿病等疾病，是全球慢性疾病的主要危險因素之一[1]。肥胖可能會誘發糖尿病，而嚴重的糖尿病會增加骨質疏松和脆性骨折的風險，其原因可能是機體血糖升高，引起抗氧化酶的糖基化，使機體抗氧化能力下降，活性氧(reactive oxygen species，ROS)生成增多，引起氧化應激水平的增加[2]，進而導致骨質流失。

晚期糖基化終產物(advanced glycation end products，AGEs)及其受體(RAGE)/核轉錄因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)信號通路是與氧化應激密切相關的經典通路之一。AGEs是葡萄糖對蛋白質的自發性非酶糖化和糖代謝的產物，過度積累會引起許多病理變化[3]。骨組織中，AGEs一方面可以通過與其受體RAGE結合，促進組織細胞生成ROS，激活NF-κB參與的炎癥等反應，從而刺激骨吸收并抑制骨形成；另一方面，AGEs可影響骨材料構成誘發骨質量下降[4]。

研究發現，馬錢苷主要來源于藥材山茱萸，具有降血糖和調節骨代謝等多種藥理作用[5-6]，馬錢苷通過抑制AGEs通路，可減輕氧化應激、炎癥和凋亡引起的代謝異常[7]。含黃連素的主要藥材黃連具有抗糖尿病和抗骨質疏松等作用。Xie等[8]提出黃連素可以促進骨形成，抑制骨吸收，恢復糖尿病大鼠的骨代謝穩態。本課題組前期研究表明，含有馬錢苷和黃連素的降糖消渴顆粒能抑制KKAy小鼠的骨丟失[9]。但馬錢苷和黃連素聯合用藥能否通過調控AGEs/RAGE/NF-κB信號通路抑制糖尿病誘發的骨丟失作用，目前還未知。因此，本研究以高脂飲食誘發的糖尿病小鼠模型為研究對象，探討骨組織中AGEs/RAGE/NF-κB通路的變化及降糖消渴顆粒的主要成分馬錢苷與黃連素對其的影響，以闡釋其治療糖尿病并發的骨質疏松的作用機制，為中藥防治糖尿病性骨質疏松提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物SPF級雄性ICR小鼠,(20±2)g，購自北京斯貝福動物科技有限公司，飼養于北京中醫藥大學科研實驗中心清潔級動物實驗室，合格證號SYXK(京)2016-0038，恒定室溫(22±2)℃，相對濕度(50±5)%，12 h/12 h光暗周期。實驗過程中所有小鼠可自由飲用水及食物，籠具、墊料、飲用水等定期更換、清潔。實驗方案經北京中醫藥大學動物實驗倫理委員會批準。

1.2 主要儀器拜安康血糖儀及配套血糖檢測試紙(德國拜耳醫藥保健有限公司)；EchoMRI-100H身體成分分析儀(美國EchoMRI國際醫療設備公司)；RM 2255輪轉式切片機(德國Leica Biosystems有限公司)；Olympus BX53倒置熒光顯微鏡(日本Olympus有限公司)；FLUO star Omega多功能酶標儀(德國BMG Labtech公司)；Azure c500凝膠成像儀(美國Azure Biosystems股份有限公司)；小動物活體micro-CT影像系統(美國PerkinElmer公司)；CT3質構儀(美國brookfield公司)；傅里葉變換紅外光譜儀(德國Bruker公司)。

1.3 藥物與試劑馬錢苷(馬錢素)、黃連素(鹽酸小檗堿)(成都瑞芬思生物科技有限公司，MD10B、Y035)；鹽酸二甲雙胍片(中美上海施貴寶制藥有限公司，H20023370)；總膽固醇(total cholesterol，TC，A111-1-1)、三酰甘油(triacylglycerol，TG，A110-1-1)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL-C，A112-1-1)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C，A113-1-1)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD，A001-3-2)、丙二醛(malondialdehyde，MDA，A003-1-2)、總抗氧化能力(total antioxidant capacity，T-AOC，A015-3-1)測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)；NF-κB-p65、p-NF-κB-p65(ser536)抗體(沈陽萬類生物科技有限公司，WL01980、WL02169)；AGEs、RAGE、Cathepsin K抗體(上海艾博抗貿易有限公司，ab23722、ab37647、ab19027)；ECL超敏發光液(北京索萊寶生物科技有限公司，P0018FS)；骨組織抗原修復液(上海舜百生物科技有限公司，SBT10013)；高脂飼料，包括45%脂肪、20%蛋白質和35%碳水化合物(江蘇美迪森生物醫藥有限公司，MD12032)；普通飼料采用AIN-96G全價營養飼料(北京斯貝福生物技術有限公司)。

1.4 動物模型構建用高脂飼料連續喂養ICR小鼠12周[10]，選取體質量增加≥20%、空腹血糖>7.8 mmol·L-1的小鼠用于后續實驗。將符合條件的小鼠隨機分為高脂飲食誘導糖尿病模型組(HFD，n=10)、二甲雙胍陽藥組(Met，n=10)和馬錢苷與黃連素聯合治療組(L+B，n=10)，3組小鼠均用高脂飼料繼續喂養至實驗結束。陽藥組小鼠灌服二甲雙胍(100 mg·kg-1)，治療組小鼠灌服馬錢苷與黃連素(馬錢苷20 mg·kg-1，黃連素50 mg·kg-1)，模型組小鼠灌服等量的水，另外再取10只正常小鼠灌服等量水作為對照(正常飼料飼養)，連續給藥10周。

1.5 取材及樣品制備摘眼球取血，收集血液樣本用于血清學檢測。同時，迅速剝離小鼠股骨和脛骨，部分骨組織用4%多聚甲醛固定做組織學分析，剩余在液氮中冷凍后置-80 ℃保存備用。

1.6 指標測定

1.6.1體質量及空腹血糖 實驗期間每周記錄一次小鼠體質量及空腹血糖，取材前用身體成分分析儀檢測小鼠體脂并記錄。

1.6.2口服葡萄糖耐量實驗(oral glucose tolerance test，OGTT) 小鼠空腹12 h后進行糖耐量實驗。每只小鼠灌胃給予葡萄糖溶液(2 g·kg-1)，分別檢測灌胃后0、30、60、90、120 min的血糖，繪制血糖變化折線圖，并計算曲線下面積(area under the curve,AUC)。

1.6.3Micro-CT 將脛骨固定于micro-CT影像系統成像床上，設置電壓為70 kV，電流為60 μA，成像視野36 mm × 36 mm，掃描模式為14 min高分辨率，使用相應X射線劑量進行掃描。成像結果使用Analyze 2.0軟件進行分析。分別選取骨骺端生長板以下75層[11]以及骨干中段[12]作為特定興趣區域，分析以下參數：(1)骨小梁：節段骨表面與節段骨體積之比(bone surface/bone volume，BS/BV)、骨小梁數目(trabecular number，Tb.N)、骨小梁分離度(trabecular separation，Tb.Sp)；(2)皮質骨：皮質骨骨密度(bone mineral density，BMD)、骨膜包膜內的總橫截面積(total cross-sectional area，Tt.Ar)和骨膜周長(periosteal perimeter，Ps.Pm)。

1.6.4三點彎曲實驗 利用CT3質構儀測定脛骨的生物力學性能，將模具的間距設置為12 mm，固定好脛骨，保持脛骨中心、兩支點中心和加載點在同一位置，然后以0.5 mm·s-1的下降速度設置加載負荷，得到最大載荷參數值。

1.6.5ATR傅里葉變換紅外光譜檢測 脛骨去骨髓后研磨成細粉并干燥。取微量細粉置于晶體表面，開始檢測。對每個樣品采集紅外光譜，利用origin軟件處理光譜，對以下參數進行分析：(1)膠原成熟度(collagen maturity/collagen cross-link ratio，XLR)反映成熟和不成熟類型交聯的相對數量，即氨基化合物 Ⅰ 在1 660 cm-1和1 690 cm-1的峰高比值；(2)礦物 ∶基質(mineral ∶matrix ratio)表示膠原基質的礦化程度，即ν1-ν3PO4和酰胺Ⅰ的峰面積比；(3)碳酸鹽 ∶磷酸鹽(carbonate ∶phosphate ratio)表示碳酸鹽取代礦物晶格的程度，即ν1-ν3PO4與ν2CO3的峰面積比；(4)礦物結晶度(mineral maturity/crystallinity，MMC)反映晶體大小和化學組成，即化合物在1 030 cm-1和1 020 cm-1的峰高比值[13]。

1.6.6血清學指標檢測 TG、TC、HDL、LDL以及MDA、SOD、T-AOC的測定采用商品化試劑盒，并按照生產說明書操作。

1.6.7HE染色 取小鼠股骨制作石蠟切片，按照陳貝貝等[14]提供的方法進行HE染色，骨組織切片于60 ℃烘箱中烤3 h，然后按常規程序進行HE染色，封片后顯微鏡下觀察骨小梁的病理特征并拍照記錄。

1.6.8TRAP染色 取無水乙酸鈉、酒石酸、冰醋酸配置成基礎溶液，預熱至37 ℃。骨組織石蠟切片，在含萘酚AS-BI磷酸鹽溶液和基礎溶液的染色缸中37 ℃孵育45 min。然后將亞硝酸鈉與副品紅配成的棕色染料倒入另一個含基礎溶液的染色缸中并放入未清洗的切片，室溫孵育6 min，蘇木精復染，再用氨水返藍，清洗后封片。

1.6.9免疫組化測定(IHC) 取股骨石蠟切片，按照王麗麗等[15]提供方法進行實驗，簡述如下：10%山羊血清封閉，分別孵育AGEs(1 ∶200)、RAGE(1 ∶100)、p-NF-κB-p65(1 ∶100)、NF-κB-p65(1 ∶100)、Cathepsin K(1 ∶50)抗體，4 ℃過夜。次日滴加辣根過氧化物酶標記的二抗，DAB溶液避光顯色，蘇木精復染，封片后置于顯微鏡下觀察、拍照，利用Image-Pro Plus軟件分析。

2 結果

2.1 馬錢苷與黃連素聯合用藥能抑制糖尿病小鼠體質量、體脂率和空腹血糖的增加如Fig 1A-C所示，與正常組小鼠相比，模型組小鼠的體質量、體脂率和空腹血糖均增加明顯(P<0.05)。與模型組相比，馬錢苷與黃連素聯合給藥2周后體質量開始明顯降低(P<0.05)，給藥10周后小鼠體脂率及空腹血糖明顯下降(P<0.05)。這說明，馬錢苷與黃連素聯合用藥可有效降低糖尿病小鼠的血糖和體脂率，抑制體質量增加。

2.2 馬錢苷與黃連素聯合用藥能改善糖尿病小鼠的血脂水平及糖耐量如Fig 2A-D，與正常組相比，模型組小鼠血清TG、TC、LDL水平明顯增加，HDL水平明顯降低(P<0.05)。聯合給藥干預10周后明顯逆轉了糖尿病小鼠血清中TG、TC、LDL和HDL水平(P<0.05)。如Fig 2E所示，第10周各組小鼠的糖耐量測試結果顯示，與正常組相比，模型組小鼠的血糖值在0、30、60、90、120 min均處于較高水平，而聯合治療組小鼠各時間點的血糖水平較模型組明顯降低(P<0.05)。Fig 2F所示，計算第10周OGTT實驗結果的AUC，模型組小鼠AUC相較正常組升高了60.9%(P<0.05)，而陽藥組和馬錢苷與黃連素聯合治療組小鼠相較模型組AUC分別降低了26.5%和32.6%(P<0.05)。以上結果表明，高脂飲食喂養的小鼠血脂水平紊亂，葡萄糖耐量受損，而馬錢苷與黃連素聯合用藥可以改善糖尿病小鼠的血脂水平和修復受損的糖耐量。

Fig 1 Effects of combined administration of loganin and berberine on body weight (A),body fat content (B)and fasting blood-glucose,FBG (C)in diabetic mice *P<0.05 vs model group;#P<0.05 vs control group.

Fig 2 Effects of combined administration of loganin and berberine on glucose and serum lipid parameters in diabetic n=10)A:Serum TG;B:serum TC;C:Serum LDL;D:Serum HDL;E:OGTT at 10th week;F:AUC of OGTT at 10th week.*P<0.05 vs model group;#P<0.05 vs control group.

2.3 馬錢苷與黃連素聯合用藥能改善糖尿病小鼠的骨微結構和骨生物力學性能如Fig 3A所示，正常組小鼠骨小梁結構完整，模型組結構稀疏，陽藥組和馬錢苷與黃連素聯合治療組小鼠的骨小梁結構得到改善。CT分析結果(Fig 3B-G)也與此一致：與正常組比較，模型組小鼠脛骨的Tb.Sp明顯升高(P<0.05)，BS/BV、Ps.Pm、BMD降低(P<0.05)，Tt.Ar、Tb.N亦有降低趨勢；與模型組比較，聯合治療10周后小鼠的Tb.Sp明顯下降(P<0.05)，BS/BV、Ps.Pm、BMD、Tt.Ar、Tb.N明顯升高(P<0.05)。小鼠脛骨生物力學的測定結果如Fig 3H所示，相較于正常組，模型組小鼠最大載荷明顯降低(P<0.05)；給藥干預10周后，與模型組小鼠比較，聯合治療組小鼠的最大載荷明顯升高(P<0.05)。以上結果提示，糖尿病小鼠骨微結構受損，骨生物力學下降；馬錢苷與黃連素聯合給藥后，其骨微結構和骨強度得到明顯改善。

2.4 馬錢苷與黃連素聯合用藥能改善糖尿病小鼠的骨材料構成骨材料構成也是評價骨質量的重要因素，Fig 4A是各組小鼠骨質的紅外光譜圖，其分析結果如Fig 4B-E。與正常組比較，模型組小鼠的膠原礦化程度、碳酸鹽替代程度、礦物成熟度以及膠原蛋白成熟度都明顯升高(P<0.05)，給藥干預10周后各項指標均下降(P<0.05)。這些結果表明，馬錢苷與黃連素聯合治療能改善糖尿病小鼠的骨材料構成。

2.5 馬錢苷與黃連素聯合用藥能改善糖尿病小鼠骨組織病理改變HE染色顯示(Fig 5A)，正常組小鼠股骨中骨小梁致密，厚度較大，未出現脂滴樣空泡，而模型組小鼠骨小梁稀疏，厚度降低，存在大量脂滴樣空泡。陽藥組及聯合治療組小鼠股骨的整體病變程度低于模型組，提示馬錢苷與黃連素能夠改善糖尿病小鼠骨微結構。TRAP染色結果表明(Fig 5B)，與正常組小鼠比較，模型組小鼠股骨中破骨細胞數目明顯增加，藥物聯合干預后數目降低(P<0.05)。這說明，糖尿病小鼠破骨細胞的骨吸收活性增加，骨微結構被破壞，而馬錢苷與黃連素聯合用藥可以改善糖尿病小鼠骨組織病理變化，可能與其抑制破骨細胞的骨吸收有關。

2.6 馬錢苷與黃連素聯合用藥能降低糖尿病小鼠血清氧化應激水平MDA、SOD、T-AOC用于評估機體氧化損傷的程度。如Fig 6A-C所示，與正常組相比，模型組小鼠血清MDA水平明顯升高(P<0.05)，血清SOD和T-AOC水平明顯降低(P<0.05)；而與模型組相比，聯合治療組小鼠血清MDA和SOD水平明顯改善(P<0.05)，T-AOC水平亦有升高趨勢。以上結果說明，糖尿病小鼠血清氧化應激水平升高，馬錢苷與黃連素聯合用藥能減輕機體氧化應激反應。

Fig 3 Effects of combined administration of loganin and berberine on bone microstructure and biomechanics in diabetic n=10)A:Micro-CT scanning stereogram of tibial metaphysis in mice;B:Trabecular bone separation,Tb.Sp;C:Ratio of segmental bone surface to segmental bone volume,BS/BV;D:Periosteal perimeter,Ps.Pm;E:Bone mineral density,BMD;F:Number of bone trabeculae,Tb.N;G:Total cross-sectional area in the periosteum,Tt.Ar;H:Maximum load/bone volume.*P<0.05 vs model group;#P<0.05 vs control group.

Fig 4 Effects of combined administration of loganin and berberine on bone material properties in diabetic n=10)A:The infrared spectra;B:Mineral:matrix ratio;C:Carbonate:phosphate ratio;D:Mineral maturity (1 030 cm-1:1 020 cm-1);E:Collagen maturity/Collagen cross-link ratio (1 660 cm-1:1 690 cm-1).*P<0.05 vs model group;#P<0.05 vs control group.

Fig 5 Effects of combined administration of loganin and berberine on bone histopathological changes in diabetic miceA:HE staining,pink -bone trabeculae,purple -bone marrow;B:TRAP staining,red -osteoclasts (arrow),dark blue -bone marrow,light blue -bone.

Fig 6 Effects of combined administration of loganin and berberine on serum oxidative stress markers in diabetic n=10)A:MDA;B:SOD;C:T-AOC.*P<0.05 vs model group;#P<0.05 vs control group.

2.7 馬錢苷與黃連素可能通過調節AGEs/RAGE/NF-κB信號通路調節骨代謝如Fig 7A、B所示，與正常組小鼠相比，模型組小鼠股骨中AGEs和RAGE表達明顯增加(P<0.05)，而與模型組小鼠相比，藥物干預10周后其水平明顯降低(P<0.05)。NF-κB的活化是指p65亞基被磷酸化激活后向核內轉移發揮生理作用。如Fig 7C和7D所示，模型組小鼠股骨中NF-κB-p65與p-NF-κB-p65較正常組小鼠明顯升高(P<0.05)，馬錢苷與黃連素聯合治療的小鼠其水平明顯降低(P<0.05)。這些結果提示，馬錢苷與黃連素聯合用藥能明顯抑制糖尿病小鼠體內AGEs的積累，從而抑制ROS誘發的NF-κB活化。

免疫組化染色測定各組小鼠組織蛋白酶K(Cathepsin K)的表達量如Fig 7E所示，與正常組相比，模型組小鼠股骨中Cathepsin K表達明顯增多(P<0.05)，聯合治療組小鼠Cathepsin K的表達較模型組小鼠明顯降低(P<0.05)。這說明，馬錢苷與黃連素聯合能降低Cathepsin K的表達。以上免疫組化染色結果表明，馬錢苷與黃連素聯合可以調節Cathepsin K的表達，抑制破骨細胞的骨吸收活性，從而改善糖尿病小鼠的骨質量。

Fig 7 Expressions of AGEs,RAGE,NF-κB-p65,p-NF-κB-p65 and Cathepsin K in femurs of diabetic mice determined by n=10)A:Immunohistochemical staining and analysis of AGEs;B:Immunohistochemical staining and analysis of RAGE;C:Immunohistochemical staining and analysis of NF-κB-p65;D:Immunohistochemical staining and analysis of p-NF-κB-p65;E:Immunohistochemical staining and analysis of Cathepsin K.*P<0.05 vs model group;#P<0.05 vs control group.

3 討論

本研究利用經典的高脂飲食誘導法復制糖尿病小鼠模型，發現小鼠成模后體質量增加，體脂率升高，小鼠血糖水平升高，糖耐量降低，血脂紊亂，血清氧化應激水平升高；同時，其骨微結構被破壞，骨強度降低，骨材料構成改變；破骨細胞數目明顯增加；AGEs/RAGE/NF-κB信號通路相關蛋白及Cathepsin K表達增加，馬錢苷與黃連素聯合治療小鼠10周后，可明顯逆轉上述改變，從而調節小鼠的骨代謝。

本研究通過分析小鼠骨微結構、骨強度等一般情況，發現糖尿病骨質疏松小鼠骨小梁結構稀疏，硬度下降，呈現骨質疏松癥狀，該結果與文獻報道一致[16]。馬錢苷與黃連素干預后能明顯升高BS/BV、Ps.Pm、BMD、Tt.Ar、Tb.N，降低Tb.Sp，提示馬錢苷與黃連素聯合干預具有調節骨代謝紊亂，改善骨結構的作用。Doucette等[17]提出高脂喂養C57BL/6J小鼠12周后皮質骨無明顯變化。而本實驗中，模型組小鼠22周后皮質骨BMD及Ps.Pm有明顯改變，可能是因為前期高脂飲食對骨小梁的影響更明顯，而本實驗中小鼠高血糖癥狀進一步加重骨代謝紊亂。有研究報道，隨著骨組織年齡增加，礦物基質比、碳酸鹽取代礦物晶格的程度、MMC以及XLR都會升高[13]。本實驗顯示高脂飲食喂養的小鼠脛骨骨質在22周后也得出一致的結果，聯合給藥后礦物基質比、碳酸鹽取代礦物晶格的程度、MMC以及XLR都明顯下降，治療作用明顯，提示馬錢苷與黃連素具有調控骨材料構成的作用。

AGEs/RAGE/NF-κB信號通路在氧化應激和骨代謝過程中發揮著重要作用，可以調控ROS的產生及骨吸收活性。研究發現，馬錢苷可抑制AGEs通路，減少ROS的產生[7]。此外，馬錢苷具有較強的抑制NF-κB信號通路的作用[18]。體外研究也證實黃連素具有抗氧化作用，在一定程度上可抑制骨質疏松癥的發展[8]。在本研究中，通過檢測血清MDA、SOD和T-OAC，發現糖尿病小鼠氧化應激水平較高，骨組織也發生明顯病變。而馬錢苷與黃連素聯合干預糖尿病小鼠10周后，血清MDA降低，SOD、T-AOC升高；HE染色、TRAP染色、IHC結果均表明馬錢苷與黃連素能夠改善骨質量，減輕骨組織空泡化等病變，明顯降低AGEs、RAGE、NF-κB-p65、p-NF-κB-p65和破骨細胞特異性標志物TRAP及Cathepsin K的表達水平，具有減輕機體氧化應激、恢復骨代謝平衡的作用。以上研究結果表明，馬錢苷與黃連素聯用可通過調節AGEs/RAGE/NF-κB信號通路，降低糖尿病小鼠機體氧化應激水平，進而改善骨結構與骨強度，發揮骨保護作用。

綜上所述，馬錢苷與黃連素聯用可以抑制骨吸收活性，進而改善骨質量，其作用機制與AGEs/RAGE/NF-κB信號通路有關。本研究為馬錢苷與黃連素及其復方抗糖尿病性骨質疏松的臨床應用提供了一定的科學依據，也為其他降糖藥影響骨代謝的研究提供了思路。