基于網絡藥理學初探雷公藤干預狼瘡性腎炎的效-毒作用

申安平，李 桓，王炳森，李曉坤，李松偉

(河南中醫藥大學 1.研究生院、2.第一臨床醫學院、3.藥學院、4.第二附屬醫院，河南 鄭州 450000)

狼瘡性腎炎(lupus nephritis，LN)是系統性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)累及腎臟致免疫復合物沉積而形成的炎癥性腎病，病程較長且易反復發作，若不及時控制可造成嚴重的腎臟損傷。LN尚無對應的中醫病名，可根據臨床癥狀將其歸類為“腎痹”“陰陽毒”等范疇，病因病機為風濕內擾于腎。雷公藤為衛矛科藤本植物雷公藤的干燥根，其味苦辛，能燥能行，祛風除濕、活血通絡，治療LN風濕擾腎證[1]。現代藥理研究發現雷公藤具有抗炎、止痛和免疫抑制等作用，具有與糖皮質激素相似的治療效應，已成為國內治療狼瘡性腎炎的常用藥物。但是雷公藤制劑也會造成腎功能衰竭、腎功能不全、血尿、少尿、肌酐升高等與腎臟相關的不良反應[2]，因此，LN治療選用雷公藤時應該更加謹慎。本研究采用網絡藥理學方法構建雷公藤干預LN的作用機制網絡，分析作用網絡中的關鍵靶點和信號通路，探討雷公藤對LN的效-毒作用，為進一步研究評價雷公藤治療LN整體效果提供思路及依據。

1 材料與方法

1.1 數據庫及軟件本研究利用中草藥系統藥理學平臺(TCMSP)數據庫獲取雷公藤主要活性成分及靶點；從CoolGeN數據庫、OMIM數據庫和GeneCards數據庫中搜集狼瘡性腎炎相關靶點；運用Uniprot數據庫將獲得的蛋白靶點名稱標準化后通過STRING數據庫分析蛋白相互作用關系；使用Venny在線工具及Cytoscape3.7.1軟件分析藥物疾病共同靶點形成韋恩圖，并構建“藥物-成分-靶點圖”和蛋白互作網絡圖。

1.2 雷公藤成分及靶點篩選基于中藥系統藥理學數據庫和分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)(http://tcmspw.com/tcmsp.php)收集雷公藤的化學成分。根據吸收、分布、代謝、排泄ADME參數篩選出同時滿足口服利用度(OB)≥30%和類藥性(DL)≥0.18的化學成分并預測其靶點。通過Uniprot(http://www.uniprot.org/)數據庫將所得靶點蛋白名轉化為標準基因名稱。

1.3 狼瘡性腎炎相關靶點收集和篩選基于人類孟德爾遺傳綜合數據庫(online mendelian inheritance in man，OMIM)(http://www.omim.org/)、在線文本挖掘工具CoolGeN數據庫(http://ci.smu.edu.cn/CooLGeN/Home.php)和GeneCards數據庫(http://www.genecards.org/)，以“lupus nephritis”為關鍵詞收集與狼瘡性腎炎相關的疾病靶點。為增加疾病靶點的可信度，收集過程中根據疾病基因出現頻率刪除支撐文獻較少的靶點。將檢索結果合并去重得到LN疾病靶點數據庫。

1.4 雷公藤對LN作用靶點預測將雷公藤成分靶點和狼瘡性腎炎靶點數據庫導入Venny2.1(http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)分析得到兩者共同靶點，即為雷公藤治療LN的潛在作用靶點。采用Cytoscape3.7.1軟件繪制雷公藤-活性成分-潛在作用靶點-LN網絡模型。

1.5 蛋白質-蛋白質相互作用網絡的構建雷公藤對LN的治療效應是多個蛋白交互作用的結果。使用蛋白質相互作用網絡數據庫(STRING11.0)(https://string-db.org/Version 11.0)分析雷公藤治療LN的作用靶點，限定物種為人(homo sapiens)，構建蛋白質-蛋白質相互作用網絡(protein-protein interaction，PPI)，去掉游離的靶點，篩選置信度0.400以上的蛋白互作關系數據，將其導入Cytoscape3.7.1軟件可視化作用靶點的PPI網絡。

1.6 GO和 KEGG富集分析為了解中藥的靶點蛋白在基因功能和信號通路中的作用，將雷公藤治療LN靶點導入采用注釋、可視化和集成發現數據庫(the database for annotation,visualization and integrated discovery,DAVID6.7)(https://David.ncifcrf.gov/)DAVID6.7數據庫，進行基因本體(gene ontology，GO)功能富集與京都基因與基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG))通路富集分析，P<0.05，并按照所含的靶點數目進行排序，篩選有統計學意義且可靠的生物過程和通路。

2 結果

2.1 雷公藤成分靶點和狼瘡性腎炎疾病靶點篩選通過TCMSP數據庫篩選得到雷公藤52種潛在藥效成分和對應的167個相關靶點，剔除22個沒有對應靶點的成分和94個重復靶點，得到30個藥物有效成分和73個對應的靶點，其中多個成分可以共同作用于一個靶點，成分triptolide、tripterine、kaempferol對應的靶點尤多。在CoolGeNCool、OMIM和GeneCards 3個疾病數據庫中搜索“lupus nephritis”，去重后共得到1 227個與狼瘡性腎炎相關的靶點。

2.2 雷公藤-狼瘡性腎炎治療靶點預測利用VENNY2.1將73個藥物靶點與1 227個疾病靶點取交集，藥物-疾病共同靶點共有38個，見Fig 1，即為雷公藤治療狼瘡性腎炎的作用靶點。利用Cytoscape3.7.1構建雷公藤-LN調控網絡，如Fig 2，圖中橘紅色圓形代表雷公藤有效成分，藍色圓形代表雷公藤-LN共同靶點基因。

Fig 1 Intersection of predicted targets of Tripterygium wilfordii Hook.f.target and LN

2.3 作用靶點蛋白互作關系與核心靶點篩選在String中分析得到雷公藤-狼瘡性腎炎作用靶點的PPI網絡，包括35個節點，207條邊。以節點大小和顏色深度代表相鄰節點數目，相鄰節點越多，節點越大，顏色越深，在PPI網絡中的地位就越重要。以邊的粗細代表Combined score，即相互關系的綜合得分，Combined score值越高，邊越粗，兩個節點的連接質量越高。Degree值>13的靶點有13個，具體如Fig 3。

Fig 2 Component-target network of Tripterygium wilfordii Hook.f.in treatment of lupus nephritis

Fig 3 PPI network of Tripterygium wilfordii Hook.f.for LN

2.4 雷公藤-狼瘡性腎炎作用基因的生物學過程GO富集分析結果顯示雷公藤-狼瘡性腎炎作用基因的生物過程(biological process,BP)顯著富集在凋亡的調節、細胞增殖的調節、細胞通訊的正調控、信號轉導的調控、細胞發育的調控、對腫瘤壞死因子的反應、免疫系統發育、對細胞遷移的調控、NF-κB級聯的調控、白細胞黏附等；細胞組分(cell component,CC)主要富集在細胞外區域部分、胞質溶膠、細胞器內腔、膜封閉腔、核腔、細胞表面、基底膜等；分子功能(molecular function,MF)主要富集在類固醇激素受體活性、配體依賴性核受體活性、半胱氨酸型內肽酶活性、序列特異性DNA結合、蛋白復合物結合、轉錄因子活性、細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶調節劑活性等。按照統計學P值由小到大部分展示，見Tab 1。

2.5 雷公藤-狼瘡性腎炎作用基因的生物學通路KEGG通路富集結果顯示雷公藤-狼瘡性腎炎主要富集在細胞凋亡途徑(apoptosis)、黏著斑途徑(focal adhesion)、NOD樣受體信號通路(NOD-like receptor signaling pathway)、p53信號通路(p53 signa-ling pathway)、Toll樣受體信號通路(Toll-like receptor signaling pathway)、RIG-I樣受體信號通路(RIG-I-like receptor signaling pathway)、MAPK信號通路(MAPK signaling pathway)等，見Tab 2。

Tab 1 GO enrichment of potential targets from Tripterygium wilfordii for lupus nephritis

Tab 2 KEGG enrichment results of Tripterygium wilfordii Hook.f.-lupus nephritis treatment targets

3 討論

3.1 富集通路分析根據KEGG通路富集結果分析，雷公藤對LN治療作用主要表現在抑制免疫及炎癥、腎間質纖維化和血管損傷等方面，見Fig 5。①調控免疫及炎癥：NOD樣受體家族、RIG-Ⅰ受體家族和Toll樣受體家族等模式識別受體是免疫系統的重要組成部分。NOD樣受體信號通路在狼瘡性腎臟疾病中介導早期炎癥反應、炎癥因子的致纖維化作用、誘導腎臟固有細胞轉分化、促使腎小球系膜細胞增殖等[3]。核心靶點RELA、CASP8、MAPK8等富集在此通路中，RELA作為NF-κB的組分可能通過上調促炎癥介質和促進巨噬細胞浸潤而加劇腎組織炎癥的發生；MAPK8激活胞內轉錄因子c-jun氨基末端激酶等調節腎組織炎癥反應和纖維化過程[4]，在狼瘡樣小鼠腎組織中表達上調,成分雷公藤甲素使MAPK8進核受阻從而抑制促炎細胞因子的釋放[5]。RIG-Ⅰ受體信號通路和TOLL樣受體信號通路也可促進促炎因子和干擾素IFN等分子的表達，引起LN的異常炎癥反應，參與腎臟增生性改變[6]。富集在這兩條通路中的核心靶點FOS組成激活子蛋白AP-1，通過下游促炎分子網絡參與LN腎小管間質損傷[7]。②抑制腎間質纖維化和血管損傷：P53信號通路可通過誘導凋亡和抑制增殖促進腎臟系膜細胞增生的恢復[8]。在此通路中，細胞周期調控蛋白CCND1能夠促使細胞持續增殖，研究證明CCND1與腎小球增殖程度密切相關,而雷公藤中雷公藤紅素等多種成分能夠下調CCND1的表達從而抑制細胞增殖[9]。黏著斑(focal adhesion)是細胞骨架的重要結構，既維持細胞整體形態，又參與信號傳遞等生命活動。富集在黏著斑通路中的靶點BCL2可調節細胞調亡,雷公藤成分川陳皮素能夠增加BCL2表達水平以調節抗凋亡機制[10]。

Fig 5 KEGG pathway of Tripterygium wilfordii Hook.f.-lupus nephritis treatment targets

3.2 核心靶點分析蛋白質相互作用網絡顯示degree>13的核心靶點還有TIMP1、PPARG、MCL1、ESR1、ICAM1、VCAM1、MYC等。TIMP1能夠抑制細胞外基質的降解促進腎小球硬化進程，還能夠抑制系膜細胞的凋亡，加劇細胞外基質的蓄積，雷公藤成分雷公藤紅素抑制腎臟TIMP1的表達，對狼瘡鼠模型的腎小球硬化有明顯的延緩作用[11]。MCL1在多種自身免疫性疾病中過表達，可能通過異常調控細胞增殖與凋亡參與LN腎小球增生性病變。ESR1編碼雌激素受體α，其表達水平與紅斑狼瘡抗ANA抗體、抗RAP抗體和臨床癥狀嚴重程度呈正相關[12]。ICAM-1、VCAM-1被多種細胞因子與炎性介質誘發表達，募集白細胞黏附于腎臟，加重炎癥反應引起組織損傷，造成腎組織微循環障礙和組織灌溉失調，最終導致腎臟功能受損，而雷公藤的多種成分對細胞表面黏附分子表達具有抑制作用[13]。原癌基因MYC,廣泛參與細胞周期、細胞凋亡、細胞轉化過程，尤其與增殖活躍的組織密切相關，可能通過誘導免疫細胞增殖紊亂而影響狼瘡發病。

3.3 潛在毒副作用預測通過查閱文獻對研究結果進行分析發現，雷公藤的主要化學成分對腎組織也具有潛在副作用，如Fig 6。CASP3能夠啟動凋亡過程，研究表明在狼瘡性腎炎中CASP3表達上調導致腎小球足細胞凋亡、蛋白尿癥狀加重，而雷公藤成分雷公藤甲素上調CASP3和CASP9的表達[14]，可能加重蛋白尿癥狀。VEGFA在PPI網絡中是核心靶點，與其受體FLT1具有保護內皮細胞和血管系統完整性的功能，能在炎癥環境中保護腎小球濾過屏障[15]，在狼瘡性腎炎中VEGFA合成降低且血清受體FLT1升高，導致腎組織內VEGFA不足，致使纖維化和蛋白尿的發生，但實驗發現雷公藤甲素等成分能在乳腺癌等疾病中下調VEGFA的表達抑制血管形成[16]，若雷公藤甲素在腎臟組織中具有相同效應，則可能加重腎臟損害；PPARG在受損腎臟細胞上表達增強，具有抗腎臟纖維化作用，雷公藤成分山柰酚和β-谷甾醇被證實分別在骨髓充質干細胞和心肌中表現出對PPARG的抑制作用[17]，其在腎組織中是否具有同樣的抑制作用并促使腎臟纖維化還需進一步研究。雄激素受體AR則在SLE發生發展中起保護性作用，雷公藤中多種成分可作用于AR降解途徑阻斷AR信號通路[18]，干擾雄激素對LN的保護作用。

Fig 6 Schematic diagram of corresponding targets ofeffective-toxic componentsPink:up-regulation;blue:Down-regulation;dotted line:potential toxicity

3.4 小結本研究發現雷公藤成分雷公藤甲素、雷公藤紅素、川陳皮素等可能通過RELA、CASP8、MAPK8、BIRC2、FOS、CCND1、BCL2等靶點，在NOD樣受體信號通路、RIG-Ⅰ受體信號通路、Toll樣受體信號通路、p53信號通路和黏著斑通路中發揮治療狼瘡性腎炎作用，其他核心靶點TIMP1、PPARG、MCL1、ESR1、ICAM1、VCAM1、MYC雖未富集在上述通路中，但也可通過蛋白質相互作用網絡發揮治療作用。有效成分雷公藤甲素具有治療作用，同時也因作用于靶點CASP3、CASP9、VEGFA可能導致蛋白尿癥狀加重、腎臟纖維化進程提前。其他成分如山柰酚和β-谷甾醇等也可能通過靶點PPARG、AR促使腎臟纖維化。

本研究運用網絡藥理學及文獻信息整合方法探討了雷公藤對狼瘡性腎炎可能的效-毒作用及其機制，為雷公藤的現代研究、靶向給藥和安全應用提供基礎。此研究中所預測的雷公藤治療LN的有效成分、作用通路和效-毒作用需更進一步深入研究、測定和臨床驗證。