基于網絡藥理學和分子對接探究桂枝湯治療新冠肺炎合并變應性鼻炎的有效成分和分子靶點

戴夢璘，蔣 槺，龔小紅，張勤修

(1.成都中醫藥大學附屬醫院耳鼻喉科，2.成都中醫藥大學臨床醫學院，四川 成都 610075；3.攀枝花市中西醫結合醫院耳鼻喉科,四川 攀枝花 617000；4.成都中醫藥大學藥學院，四川 成都 611137)

新型冠狀病毒肺炎(coronavirus disease 2019，COVID-19)是新型冠狀病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2)通過飛沫傳播、氣溶膠傳播、接觸傳播等途徑進入人體而誘發的急性呼吸道傳染病。SARS-CoV-2病毒常從鼻咽進入機體，與細胞膜上的病毒受體結合后開始復制、增殖，因此患者鼻中的SARS-CoV-2病毒載量高于咽喉部[1]。變應性鼻炎(allergic rhinitis，AR)是耳鼻咽喉科常見的過敏性疾病，發病率高，隨著環境污染日益加重，目前已影響了全球多達40%的人口[2]。患有嚴重過敏性疾病的患者可能面臨更大的COVID-19感染風險和更嚴重的臨床癥狀。韓國的一項全國性隊列研究表明，在7 340名COVID-19患者中，有4 210名(57.4%)患者患有變應性鼻炎[3]。這些患者免疫力弱、敏感性高，較其他人更易感染COVID-19，感染后也更容易出現嚴重的臨床癥狀。因此，對于感染了COVID-19的AR患者，應采取及時有效的治療措施防止癥狀加重。但目前還沒有針對COVID-19或AR的特異性藥物，因此尋找治療COVID-19合并AR的替代和補充療法非常重要。

中醫是以辨證論治為診療特點的傳統醫學，在COVID-19及AR的治療中發揮著重要的作用。在2020年2月發表的《2019新型冠狀病毒(2019-nCoV)感染肺炎快速診斷與治療指南(標準版)》中，已經將中醫療法納入COVID-19的預防和治療措施當中[4]。作為中醫經典方劑，桂枝湯(Guizhi decoction，GZD)來源于《傷寒論》，由大棗、桂枝、甘草、白芍和生姜組成。基于辨證論治的理論，桂枝湯被中醫廣泛應用于COVID-19合并AR的臨床防治中。現代藥理研究表明，桂枝湯具有抗菌、抗炎、抗病毒的作用，并能有效提高患者的機體免疫力[5]。在《新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)經方防治推薦方案(國際第1版)》中，桂枝湯被推薦為COVID-19預防方[6]。對于抵抗力弱、慢性病多發的老年人群體，湖南省推薦桂枝湯作為老年人預防COVID-19的中藥方劑[7]。此外，作為中醫經典方劑，桂枝湯對AR的治療作用也在臨床試驗中得到了證實[8]。然而，用傳統的方法來闡明桂枝湯治療COVID-19合并AR的多化合物、多靶點、多途徑的復雜機制具有挑戰性。因此，利用網絡藥理學及分子對接技術來解釋桂枝湯治療COVID-19合并AR的藥理學機制具有重要意義。

Guizhi decoctionFig 1 Venn diagram summarizing common targets of GZD,COVID-19 and AR

1 資料與方法

1.1 桂枝湯活性成分及靶基因的預測從TCMSP數據庫(https://tcmspw.com/index.php)中篩選桂枝湯的組成藥物(大棗、桂枝、甘草、白芍、生姜)的主要活性成分。篩選參數為藥物相似性(drug-likeness，DL)≥0.18、口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%。然后利用這些活性成分在TCMSP數據庫中的MOL ID號預測它們對應的靶蛋白，并借助UniProt數據庫(http://www.uniprot.org/)標準化蛋白質的基因名稱。

1.2 預測疾病相關基因在GeneCards數據庫中將物種設置為“Homo sapiens”，輸入關鍵詞“novel coronavirus”及“allergic rhinitis”來檢索與COVID-19和AR相關的靶基因。

1.3 篩選共有靶點及桂枝湯的關鍵成分借助Draw Venn Diagram網站(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)篩選藥物和疾病的共有靶點，以明晰桂枝湯、COVID-19和AR之間的聯系。應用Cytoscape 3.7.1軟件構建“中藥-活性成分-靶點”網絡，來展示共有靶點和桂枝湯中作用于這些靶點的活性成分之間的關系。然后，根據活性成分在網絡中的度值，篩選出排名前5的關鍵成分，并從PubChem數據庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)中獲得這5個關鍵成分的2D結構。

1.4 構建共有靶點的蛋白質-蛋白質相互作用網絡并進行分析將上一步獲得的共有靶點輸入到String在線數據庫中(https://string-db.org/)，物種設置為“Homo sapiens”，中等置信度=0.400，生成蛋白質-蛋白質相互作用(protein-protein interaction,PPI)網絡。利用Cytoscape 3.7.1軟件將PPI網絡可視化，并根據共有靶點在網絡中的度值進行排列，最終篩選出核心靶點。

1.5 共有靶點的基因功能富集分析利用Metascape數據庫(https://metascape.org/)，從生物過程(biological process，BP)、分子功能(molecular function，MF)、細胞成分(cellular component，CC)3個方面對共有靶點進行GO富集分析(P<0.01)。將共有靶點導入KEGG數據庫(https://www.kegg.jp/)進行KEGG富集分析，設置篩選標準為P<0.01。使用Hiplot網絡平臺(https://hiplot.com.cn)，繪制前10個GO條目(包括BP、CC、MF)和前20條KEGG通路的氣泡圖和“KEGG通路-共有靶點”網絡圖，對前10個GO條目和前20個KEGG通路進行分析。

1.6 核心靶點與關鍵成分之間的分子對接從RCSB-PDB數據庫(https://www.rcsb.org/)下載核心靶點的蛋白質3D結構，導入PyMOL 2.4.1軟件中進行氫化、脫水和配體分離。同時，通過Chembio Office軟件將關鍵成分處理為mol2格式文件。然后，利用AutoDockTools 1.5.6軟件及Autodock Vina 1.1.2軟件，進行核心靶點與關鍵成分之間的分子對接。分子對接結合能負值越高的受體分子在對接構象中越穩定。

2 結果

2.1 桂枝湯活性成分及靶基因的預測從TCMSP數據庫中檢索到桂枝湯的五味中藥共含127個活性成分，這些成分共預測到2 554個靶蛋白。從中剔除重復的靶蛋白，利用UniProt數據庫對這些蛋白的基因名標準化，得到394個靶基因。

2.2 預測疾病相關基因在GeneCards數據庫中檢索到COVID-19和AR的相關基因后，刪除其中的重復基因和得分低于中位數的基因，最終篩選出350個COVID-19相關靶點和938個AR相關靶點。

2.3 篩選共有靶點及桂枝湯的關鍵成分在Draw Venn Diagram網站生成的Venn圖中，桂枝湯、COVID-19和AR共有52個共有靶點(Fig 1)。基于所獲得的數據，結合Cytoscape 3.7.1軟件構建了一個包含165個節點和690條邊的“中藥-活性成分-靶點”網絡(Fig 2)。如Fig 2所示，5種中藥的108個活性成分作用于這52個共有靶點，桂枝中有6個，生姜中有4個，大棗中有17個，白芍中有4個，甘草中有86個。其中，β-谷甾醇、豆甾醇、槲皮素、山奈酚和 (+)-兒茶素存在于兩種或兩種以上的中藥中。網絡中按度值排名前5位的活性成分是槲皮素(78)、β-谷甾醇(36)、山奈酚(34)、柚皮素(12)和 (+)-兒茶素(12)。這5種活性成分可能就是桂枝湯發揮抗病毒、抗過敏作用以治療COVID-19合并AR的關鍵物質基礎。

Fig 2 The “herbal-active component-target”networkGreen diamonds:herbs;pink octagons:active components that belong to only one herb;red octagons:active components belonging to two or more herbs;blue round rectangles:common targets;gray lines:the interrelationships between herbs,active components,and common targets;DZ:Ziziphus jujuba;GZ:Cinnamomum cassia;GC:Glycyrrhiza uralensis;BS:Paeonia albiflora;SJ:Zingiber officinale.The active component is indicated by the MOL ID in TCMSP database.

2.4 構建共有靶點的PPI網絡并進行分析用Cytoscape 3.7.1軟件生成具有52個節點和1 151條邊的共有靶點PPI網絡(Fig 3)。在圖中形狀越大，顏色越深，靶點的度值就越高，在網絡中就越重要。比較度值發現，IL-6、TNF、MAPK3、MAPK8、IL-2、IL-10、CXCL8、IL-4、MAPK1和EGFR是排名前10的核心靶點。

2.5 共有靶點的基因功能富集分析為了闡明桂枝湯治療COVID-19合并AR的多重作用機制，本研究分別通過Metascape數據庫和KEGG數據庫對52個共有靶點進行了GO和KEGG富集分析，并獲得顯著富集的1 523個GO條目(BP 1 428個，CC 28個，MF 67個)和145條KEGG通路(P<0.01)。在Hiplot平臺上，用氣泡圖(Fig 4)展示前10個GO條目及前20條KEGG通路富集分析的情況。結果提示，BP主要涉及細胞對生物刺激的反應、T細胞活化、細胞因子產生的正調控等；CC主要涉及細胞膜區、質膜、細胞-底物連接部位等；MF主要涉及細胞因子活性、信號受體激活劑活性、受體配體活性等；KEGG通路包括Coronavirus disease-COVID-19通路、TNF信號通路、Toll樣受體信號通路、NF-κB信號通路、T細胞受體信號通路、IL-17信號通路等。觀察“KEGG通路-共有靶點”網絡圖(Fig 5)，可發現前20條KEGG通路與52個共同靶點中的43個存在相互作用。這一結果也與這20條主要通路顯著富集的結果一致。

Fig 3 PPI network of common targets

2.6 核心靶點與關鍵成分之間的分子對接通過比較排名前5的關鍵成分的2D結構，發現槲皮素的結構與山奈酚、柚皮素、(+)-兒茶素相似，因此以槲皮素作為這3種關鍵成分的代表進行分子對接。β-谷甾醇的2D結構與其它四種化合物有明顯不同，因此也選擇它進行分子對接。借助PyMOL 2.4.1軟件、AutoDockTools 1.5.6軟件和Autodock Vina 1.1.2軟件，將這兩種關鍵成分(槲皮素、β-谷甾醇)與前3個核心靶點(IL-6、TNF、MAPK3)進行分子對接。如Fig 6所示，關鍵成分與核心靶點可以很好地結合。最佳模式下，槲皮素-IL-6、槲皮素-TNF、槲皮素-MAPK3的結合能分別為-4.8、-7.2、-9.1 kcal·mol-1；β-谷甾醇-IL-6、β-谷甾醇-TNF、β-谷甾醇-MAPK3的結合能分別為 -7.2、-7.7、-7.7 kcal·mol-1。

Fig 4 Bubble diagrams of GO and KEGG enrichment analysis of common targetsThe top 10 GO (BP,CC,MF)terms and the top 20 KEGG pathways were shown in bubble diagrams.

Fig 5 The “KEGG pathway-common target”network diagramBlue nodes:the top 20 KEGG pathways;red nodes:common targets;colored lines:the connection between KEGG pathways and common targets.

Fig 6 Molecular docking resultsA：Quercetin+IL-6；B：Quercetin+TNF；C：Quercetin+MAPK3；D：Beta-sitosterol+IL-6；E：Beta-sitosterol+TNF；F：Beta-sitosterol+MAPK3

3 討論

本研究共篩選出桂枝湯的127個有效成分和394個基因靶點。經過分析Venn圖和“中藥-活性成分-靶點”網絡圖，發現桂枝湯可通過108個活性成分與52個共有靶點的結合來發揮治療作用。108個活性成分的大多數來源于甘草，這提示甘草應該是桂枝湯治療COVID-19合并AR的關鍵藥物。根據度值篩選出的關鍵成分主要屬于黃酮類、植物甾醇類和酚類；核心靶點多為促炎細胞因子。共有靶點顯著富集于1 523個GO條目和145條KEGG通路中，包括與抗病毒、抗過敏、抗炎機制相關的條目和通路，如T細胞活化、細胞因子產生的正調控、NF-κB信號通路、T細胞受體信號通路、Coronavirus disease-COVID-19通路、TNF信號通路和IL-17信號通路。最后，經過分子對接證實了關鍵成分可以自發地與核心靶點相結合。

前5位關鍵成分中，(+)-兒茶素屬于酚類化合物，β-谷甾醇屬于植物甾醇類，其他三種活性成分屬于黃酮類化合物。這表明，黃酮類、植物甾醇類、酚類化合物是桂枝湯治療COVID-19合并AR的關鍵。研究證實，黃酮類化合物不僅可以直接殺滅病毒，減輕炎癥[9]；而且還可以通過調節Th1/Th2細胞平衡來調節變應性鼻炎患者的免疫機制[10]。兒茶素可以降低血清中IgE、IL-5、IL-13的水平，恢復Th1/Th2細胞平衡，并有效的減輕AR的炎癥反應[11]。β-谷甾醇廣泛存在于多種中草藥中，具有抗病毒、抗氧化和抗菌活性，且它的抗病毒及抗過敏作用與抗病毒及免疫相關信號通路的傳導有關[12-13]。

為了確定共有靶點之間的相互作用，本研究構建了PPI網絡，并根據度值篩選出前10個核心靶點，即IL-6、TNF-α、MAPK3、MAPK8、IL-2、IL-10、CXCL8、IL-4、MAPK1和EGFR。這些靶點是桂枝湯治療COVID-19合并AR的關鍵靶點。在COVID-19的發病過程中會引發炎癥及免疫反應，還會激活多種細胞因子，如TGF-β、IL-6、STAT3等[14]。研究人員在重度COVID-19患者的血漿中也發現，TNF-α、IL-2、IL-7、IL-10等細胞因子的水平較高[15]。MAPK1、MAPK3和MAPK8廣泛存在于多種中草藥中，參與了細胞增殖、分化、轉化、凋亡等生物過程的調節，它們是治療COVID-19的重要靶點[12]。

通過分析GO條目可以發現桂枝湯在T細胞活化、細胞因子產生的正調控、膜區、質膜、細胞因子活性、受體配體活性、信號受體激活劑活性等方面具有特異性作用。桂枝湯的抗過敏和抗病毒作用與顯著富集的KEGG通路有關，這些通路包括：Coronavirus disease-COVID-19通路、TNF信號通路、Toll樣受體信號通路、NF-κB信號通路、T細胞受體信號通路及IL-17信號通路。在Coronavirus disease-COVID-19通路中有17個共有靶點參與，這表明桂枝湯可以通過這17個靶點直接作用于Coronavirus disease-COVID-19通路，從而在COVID-19的治療中發揮不可或缺的作用。NF-κB是多種損傷反應基因的多效調節因子，NF-κB信號通路可促進促炎細胞因子(如TNF-α、IL-1β、IL-6)的轉錄，它還能觸發Th1、Th17介導的免疫反應，促進IFN-γ和IL-17的釋放[16]。Toll樣受體是固有免疫和適應性免疫的重要參與者，它在識別氣道中潛在的病原體及激活相應的免疫反應的過程中起重要作用[17]。T細胞受體信號通路傳導的復雜分子機制會引起T細胞的活化，從而影響機體的免疫反應[18]。

綜上所述，本研究表明桂枝湯主要通過黃酮類、植物甾醇類、酚類等活性成分與共有靶點(IL-6、TNF、MAPK3等)的結合，來參與病毒、免疫、炎癥相關信號通路和生物細胞過程的調節，最終達到治療COVID-19與AR的目的。