丹參酮B調控LRP6/Wnt1/β-catenin通路對血管性癡呆性小鼠認知功能的影響

葉明燈，汪晶瑩，周 源，程玉潔，陳 明，俞 斐

[1.南京中醫藥大學附屬南京醫院(南京市第二醫院)藥學部，江蘇 南京 210003；2.安徽醫科大學基礎醫學院藥理學教研室，安徽 合肥 230032]

血管性癡呆(vascular dementia，VD)是指由多種腦血管疾病引起的腦部功能障礙,進而產生獲得性智能損傷的綜合征[1]。研究證實,VD作為老年癡呆的第二大形式，大約占癡呆性疾病總發生例數的20%～30%[2-3]。伴隨人口老齡化的加劇，我國VD癡呆已經逐漸成為老年性癡呆的最主要類型[4]。研究表明,導致VD的主要因素為腦血管病變，如小血管病變、大動脈病變等。腦血管病變會進一步引起控制學習、記憶功能的海馬神經元缺血，進而導致神經元損傷和細胞凋亡，并最終引起癡呆[5-6]。但是,目前臨床上有關VD的治療十分有限，而中醫藥以獨特的診療理論與方法可以通過多途徑、多靶點的方式在防治VD中發揮巨大潛力。丹參酮B(tanshinone B，TSB)是我國傳統中藥丹參的脂溶性成分代表物質之一，其具有廣泛的藥理學活性，包括改善微血管循環、清除氧自由基、抗癌以及保護血管內皮細胞等，已經成為研究熱點[7]。既往研究表明TSB在中風性大鼠、VD性小鼠中能夠改善認知功能障礙，發揮神經功能保護作用[8-9]。在VD小鼠中丹參酮ⅡA能夠通過抑制大腦皮質氧化應激，調控興奮性氨基酸和抑制性氨基酸含量，從而改善認知功能障礙。但是目前有關TSB對VD小鼠認知功能障礙的分子機制尚不完全清楚。因此，本研究將通過雙側頸總動脈縮窄法構建VD小鼠模型，闡明LRP6/Wnt1/β-catenin信號通路在VD中的作用及TSB的調控機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物雄性C57BL/6小鼠，體質量(20～22)g，周齡6～8周，動物由安徽醫科大學實驗動物中心提供，合格證號：SCXK(皖)2017-001，該實驗通過了動物實驗醫學倫理委員會批準。

1.2 藥物與試劑丹參酮B(西安冠宇生物技術有限公司，純度≥98，批號：112246-15-8)；鹽酸多奈哌齊(donepezil，DP)粉末(SELLECK公司，純度≥99，批號：120011-70-3)；蘇木精-伊紅(hematoxylin and eosin staining，HE)染色液(碧云天生物技術公司，批號：C0105S)；MDA、SOD以及GSH-Px測定試劑盒(南京建成生物工程共公司)；p-LRP6兔單克隆抗體(美國Cell Signaling Technology，批號：5583)；LRP6兔單克隆抗體(美國Cell Signaling Technology，批號：14220)；Wnt1小鼠單克隆抗體(美國Cell Signaling Technology，批號：15071)；β-catenin小鼠單克隆抗體(美國Cell Signaling Technology，批號：89477)；β-actin小鼠單克隆抗體(江蘇碧云天生物技術公司，批號：5174)；一抗、二抗稀釋液(江蘇碧云天生物技術公司，批號：P0023A-100ml)；山羊抗小鼠(江蘇碧云天生物技術公司，批號：A0286)；山羊抗兔(江蘇碧云天生物技術公司，批號：A0277)；極超敏ECL發光試劑盒(江蘇碧云天生物技術公司，批號：P0018FS)。

1.3 儀器G22-W型高速離心機(湖南湘儀實驗室儀器有限公司)；SuPerMax 3000FA型多功能酶標儀(Thermo賽默飛世爾)；M371450型組織渦旋儀(武漢維塞爾生物科技有限公司)；TC-XDS-500C型熒光倒置顯微鏡(日本/奧林巴斯Olympus)；Western blot檢測裝置(美國Bio-Rad伯樂公司)；GoodLook-1000型成像系統(美國Bio-Rad伯樂公司)。

1.4 動物分組與處理60只雄性C57BL/6小鼠，按照隨機數字表法分為對照組(Control組)、血管性癡呆模型組(VD組)、丹參酮B低劑量組(TSB 2 mg·kg-1)、丹參酮B中劑量組(TSB 4 mg·kg-1)、丹參酮B高劑量組(TSB 8 mg·kg-1)以及陽性藥物組(鹽酸多奈哌齊1 mg·kg-1)，每組各10只。采用小鼠雙側頸總動脈縮窄法構建VD模型[10]待造模成功10 d后，其中丹參酮低、中、高劑量組腹腔注射丹參酮B，陽性藥物組腹腔注射鹽酸多奈哌齊，每日1次，Control組以及VD組小鼠腹腔注射等量生理鹽水，共計20 d。

1.5 Morris水迷宮行為學實驗各組雄性C57BL/6小鼠于給藥處理20 d后，采用Morris水迷宮實驗檢測小鼠的空間記憶能力。(1)定位航行實驗：各組小鼠在第一象限入點處面向放入水中，實驗記錄在120 s內各組小鼠成功尋找并爬上平臺的時間長短，即為逃避潛伏期，之后分別從其他3個象限入口處放入水中，持續訓練5 d；(2)空間探索實驗：在實驗的d 6時，撤去平臺，并將小鼠在第一象限入點處面向放入水中，記錄小鼠60 s內的運動軌跡，計算各組小鼠通過目標象限的次數以及小鼠在原平臺游泳時間占總游泳時間的比值大小。

1.6 MDA含量、SOD、GSH-Px活性測定將各組小鼠斷頭處理后快速去除全腦組織，在冰上分離大腦皮層以及海馬組織，組織碾磨，BCA測定蛋白濃度并定量，按照各自試劑盒說明操作。

1.7 HE染色觀察海馬組織病理學形態各組小鼠乙醚麻醉后，迅速采用斷頭取腦，摘取視交叉至漏斗柄的腦片，采用4%的多聚甲醛固定各組小鼠海馬組織，脫水、透明、包埋、石蠟切片，并按照HE染色試劑盒進行海馬組織染色，顯微鏡下觀察各組小鼠海馬組織形態學變化。

1.8 Western blot實驗檢測海馬組織p-LRP6、Wnt1以及β-catenin蛋白表達取各組小鼠海馬組織，組織碾磨，裂解；BCA法測定蛋白質濃度；凝膠電泳；濕轉轉膜；上樣；用5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，孵育對應p-LRP6兔單克隆抗體(1 ∶1 000)，LRP6兔單克隆抗體(1 ∶1 000)，Wnt1小鼠單克隆抗體(1 ∶1 000)、β-catenin小鼠單克隆抗體(1 ∶1 000)以及β-actin小鼠單克隆抗體(1 ∶2 000)，4 ℃過夜，孵育對應的山羊抗小鼠二抗或者山羊抗兔二抗((1 ∶5 000)1～2 h，；搖床搖晃上加TPBS洗滌3次，5 min/次，然后加入顯影液，顯影并拍照。p-LRP6、LRP6、Wnt1和β-catenin蛋白表達表達水平以目的蛋白條帶灰度值與β-actin灰度值相比反映。

2 結果

2.1 TSB對VD小鼠行為學的影響Morris水迷宮實驗定位航行實驗顯示，與Control組小鼠相比，VD組小鼠定位航行的潛伏期明顯延長(P<0.01)。與VD組小鼠相比，TSB不同劑量組小鼠定位航行的潛伏期均不同程度性縮短(P<0.05或P<0.01)，表明TSB能夠明顯改善VD小鼠學習記憶功能(Fig 1)。Morris水迷宮實驗探索實驗顯示，與Control組小鼠相比，VD組小鼠穿越平臺次數、目標象限(第四象限)停留時間百分比均明顯減少(P<0.01)。與VD組小鼠相比，TSB組小鼠不同劑量組穿越平臺次數、目標象限(第四象限)停留時間百分比均明顯增加(P<0.05或P<0.01)(Fig 2)。

2.2 TSB對VD小鼠皮層和海馬組織MDA含量、SOD以及GSH-Px活性影響與Control組相比，VD組小鼠大腦皮層和海馬組織MDA含量明顯增加(P<0.01)，GSH-Px和SOD活性均明顯降低(P<0.01)。與VD組小鼠相比，TSB組小鼠大腦皮層和海馬組織MDA含量明顯降低(P<0.05或P<0.01)，GSH-Px和SOD活性均明顯升高(P<0.05或P<0.01)，且呈劑量依賴性(Fig 3、Fig 4)。

Fig 1 Effect of TSB on escape latency of mice n=6)**P<0.01 vs control,#P<0.05,##P<0.01 vs VD.

Fig 2 Effect of TSB on latency of mouse water maze space exploration experiment n=6)**P<0.01 vs control,#P<0.05,##P<0.01 vs VD.

2.3 TSB對VD小鼠海馬區病理組織學的影響與Control組相比，VD組小鼠海馬齒狀回處顆粒狀細胞核明顯固縮，CA1以及CA3區域海馬神經元數量均明顯減少，細胞排列紊亂、細胞大部分皺縮、部分神經元細胞核固縮、染色質出現明顯聚集等。與VD組相比，TSB不同劑量組和DP組小鼠海馬齒狀回處、CA1以及CA3區病理性損傷明顯減輕(Fig 5～Fig 7)。

Fig 4 Comparison of MDA content,SOD and GSH-Px activity in hippocampus of mice in each group n=6)**P<0.01 vs control.#P<0.05,##P<0.01 vs VD.

2.4 TSB對VD小鼠LRP6/Wnt1/β-catenin通路的影響與Control組相比，VD組小鼠海馬組織p-LRP6、Wnt1以及β-catenin蛋白表達均明顯下調(P<0.01)。與VD組相比，TSB中劑量組小鼠海馬組織p-LRP6、Wnt1蛋白表達明顯上調(P<0.05或P<0.01)，β-catenin蛋白表達無差異(P>0.05)，TSB高劑量組以及DP組小鼠海馬組織p-LRP6、Wnt1以及β-catenin蛋白表達均明顯上調(P<0.01)，TSB低劑量組小鼠海馬組織p-LRP6、Wnt1以及β-catenin蛋白表達均無差異(P>0.05)(Fig 8)。

Fig 5 Histopathological changes of hippocampal CA1 of mice in each group (HE,×200)

Fig 6 Histopathological changes of hippocampal CA3 of mice in each group (×200)

Fig 7 Histopathological changes in hippocampal dentate gyrus of mice in each group (HE,×200)

Fig 8 Effect of TSB on LRP6/Wnt1/β-catenin pathway related proteins in hippocampus of VD mice n=6)A:The bands of p-LRP6,LRP6,Wnt1,β-catenin protein.B:Quantification of p-LRP6,LRP6,Wnt1,β-catenin protein.**P<0.01 vs control,#P<0.05,##P<0.01 vs VD.

3 討論

VD是腦血管損傷導致的認知功能障礙，主要表現為神經活動、語言、學習以及記憶能力的障礙。腦部血流長期灌流不足會導致中樞膽堿功能障礙、神經元氧化應激損傷是學習和記憶能力下降的重要原因[10]。因此，本研究首先通過雙側頸總動脈縮窄法構建VD小鼠模型。Morris實驗結果顯示與Control組相比，VD組小鼠定位航行的潛伏期明顯延長、穿越平臺次數、目標象限(第四象限)停留時間百分比均顯著性減少；HE染色顯示VD組小鼠海馬齒狀回處顆粒狀細胞核明顯固縮，CA1以及CA3區域海馬神經元數量均明顯減少，細胞排列紊亂、細胞大部分皺縮、部分神經元細胞核固縮、染色質出現明顯聚集等。以上結果表明，雙側頸總動脈縮窄法構建VD小鼠模型構建成功，可用于后續藥物療效實驗。

目前臨床上有關VD患者的治療主要有藥物治療和特殊方式治療等。其中藥物包括神經保護劑、腦組織代謝改善劑等，神經遞質的替代治療是特殊方式治療的關鍵[11]。但是由于費用昂貴以及治療療效不佳使得患者依從性不高。因此，積極探尋有效的治療藥物對于改善VD患者的生活治療尤為關鍵。TSB是丹參酮ⅡA的結構類似物，具有和丹參酮ⅡA相似的藥理學活性。研究證實丹參酮ⅡA能夠通過抑制VD小鼠氧化應激，降低腦組織炎癥反應、抑制Caspase-3、促進Bcl-2表達降低海馬神經元凋亡等途徑發揮神經保護作用[12-13]。本研究通過VD小鼠腹腔注射不同劑量的TSB，觀察其治療效果，結果發現TSB能夠縮短定位航行的潛伏期、增加穿越平臺次數、目標象限(第四象限)停留時間百分比、減輕海馬齒狀回處、CA1以及CA3區病理性損傷。以上結果表明TSB對VD小鼠具有治療效果。那么有關TSB是如何發揮VD小鼠的神經保護作呢？氧化應激性損傷在神經退行性病變中發揮重要作用。在腦部血流長期灌流不足時會導致MDA含量升高、SOD以及GSH-Px活性降低。本研究結果顯示TSB能夠降低VD小鼠大腦皮層和海馬組織中MDA水平，增強SOD以及GSH-Px活性。Wnt信號通路在VD中發揮重要作用，參與調節神經元生長、發育、分化、氧化應激、凋亡以及增殖等。Wnt信號通路可以概括為經典信號通路、非經典信號通路。其中Wnt經典型號通路又被稱為Wnt/β-catenin信號通路[14]。既往研究表明，在VD大鼠中，激活Wnt/β-catenin傳導能夠明顯改善大鼠海馬神經損傷[15]。另外在帕金森病大鼠模型中Wnt/β-catenin信號通路相關蛋白Wnt1、β-catenin表達下調，GSK-3β、p-GSK-3β蛋白表達上調，抑制Wnt1能夠減輕MPP+誘導的PC12凋亡[16]。低密度脂蛋白受體相關蛋白6(low-density lipoprotein receptor-related protein6，LRP6)屬于低密度脂蛋白受體超家族成員之一[17]。既往研究表明，電針治療能夠通過調節海馬組織LRP6影響Wnt/β-catenin信號通路，減少細胞凋亡，從而促進海馬神經細胞修復。本實驗研究發現與VD組相比，TSB中、高劑量組小鼠海馬組織p-LRP6蛋白表達明顯升高。該研究結果表明TSB能夠通過調控p-LRP6，激活Wnt/β-catenin信號通路改善VD小鼠認知功能障礙。

綜上所述，本研究通過研究丹參酮B對血管性癡呆小鼠認知功能障礙的保護作用及其調控機制。結果顯示TSB能夠改善VD小鼠認知功能障礙，其機制可能與激活海馬組織LRP6/Wnt1/β-catenin通路，進而抑制小鼠大腦皮層和海馬神經元氧化應激有關。該研究結果將有助豐富VD的發生機制以及為其藥物靶點治療提供新的可能。