LncRNAs在過敏性疾病中的研究進展

王曉鈺，肖 潔，薛 玲

(山東中醫藥大學藥學院，山東 濟南 250355)

過敏性疾病是指機體接觸過敏原后，免疫系統發生紊亂的一系列疾病。該疾病特征為免疫球蛋白E(immunoglobulin E，IgE)介導的2型免疫過強，伴隨輔助性T細胞(helper T cell,Th)-1/Th2失衡，2型細胞因子，如白介素(interleukin，IL)-4、IL-5及IL-13等分泌增加。像過敏性鼻炎、過敏性哮喘、食物過敏以及特應性皮炎等均屬于這類疾病。全球有超過30%的人口受過敏性疾病的影響，并且近年來發病率不斷上升。過敏性疾病顯著降低了患者的生活質量，其反復發作的特點使患者壓力增大、抑郁、甚至可能危及生命，從而造成重大的社會經濟負擔[1]。過敏性疾病的發病機制涉及環境、免疫和基因等多種因素，目前研究主要集中于Th1和Th2失衡以及屏障功能受損，因此明確過敏性疾病的發病機理，尋求安全有效的藥物以及治療靶點迫在眉睫。

近年來研究發現，長鏈非編碼RNA(long non-coding RNAs，lncRNAs)參與諸多疾病發生和發展，可調控許多生物學過程[2]。尤其在免疫調節方面的作用越來越受到關注。在先天性或適應性免疫反應中，lncRNAs參與多種細胞的調控，像單核細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞、中性粒細胞、T淋巴細胞和B淋巴細胞均存在lncRNA的差異表達[3]。lncRNAs是免疫應答的重要調節因子，過敏性疾病的發生、發展及復發與lncRNAs密切相關，但lncRNAs在過敏性疾病中的具體作用機制尚不清楚，對其進行深入研究具有重要意義。本文將圍繞幾種常見的過敏性疾病，對lncRNAs在過敏性疾病中的研究進展進行總結。

1 lncRNA的生物學功能和基因表達的調控

絕大多數的lncRNA的轉錄和加工方式與典型的蛋白質編碼mRNA類似[4]，lncRNA經RNA聚合酶II轉錄后，再拼接，即可多聚腺苷化。但與mRNA不同的是，lncRNA富集組蛋白H3K9三甲基(H3K9me3)啟動子，并且lncRNA包含較少的低效剪接的外顯子[5]。

雖然lncRNAs缺乏開放閱讀框而不能直接編碼蛋白質，但由于lncRNAs能夠結合蛋白質、DNA和其他RNA，因此其分類和功能是多種多樣的。lncRNA又分為5類：反義lncRNA、增強子lncRNA、基因間lncRNA、雙向lncRNA和內含子lncRNA。有些lncRNA位于細胞核內，可以作為染色質修飾酶或轉錄因子的引導或支架，以順式或反式方式調控鄰近基因或整個基因組的基因表達；lncRNA能夠調控轉錄過程，其作用主要通過調控轉錄反應酶、轉錄激活分子等來發揮；lncRNA還參與了轉錄后調控、mRNA加工、剪接和轉運以及翻譯過程；lncRNA作為內源性非編碼小RNA(microRNA，miRNA)海綿，能夠競爭性結合miRNA進而調控mRNA表達，這種基于lncRNA-miRNA-mRNA的內源競爭RNA(competing endogenous RNAs,ceRNA)網絡調控模式在不同疾病中扮演著重要角色[6]。此外，有些lncRNA作為蛋白質的誘餌，能夠阻礙其功能或加工。例如，lncRNAs可以影響正常的蛋白(去)磷酸化。

2 lncRNA在過敏性哮喘中的作用

過敏性哮喘是一種常見的肺部疾病，患者常表現出氣道炎癥反應、氣道高反應性以及氣道重塑等特征。過敏性哮喘發病率的持續增加，已在全球范圍內造成了巨大的經濟負擔，嚴重影響著人們的生活質量。表觀遺傳機制在這些細胞的調節中有突出的作用，其中lncRNAs參與過敏性哮喘的發病進程，并作為關鍵分子介導多個信號通路，進而調控氣道炎癥和氣道重塑。

氣道重塑是過敏性哮喘發病過程中非常重要的環節，與氣道中多種結構和功能細胞密切相關，包括成纖維細胞活化、上皮細胞增強和氣道平滑肌細胞(airway smooth muscle cells，ASMCs)增殖。Austin等[7]對重癥哮喘患者ASMCs中差異表達的lncRNA進行檢測分析，發現其中lncRNA-plasmacytoma variant translocation(PVT1)在糖皮質激素不敏感的重度哮喘患者中過表達。進一步研究顯示，沉默lncRNA-PVT1可抑制IL-6基因和蛋白水平的表達。并且PVT1在調節重癥哮喘患者ASMCs增殖方面具有很大潛力，結果提示lncRNA-PVT1可能作為ASMCs表型的預測分子。另外，也有研究發現，lncRNA-transcription factor 7(TCF7)通過靶向線粒體內膜結構域轉位酶1(translocase of inner mitochondrial membrane domain containing 1，TIMMDC1)促進人ASMCs的生長和遷移，從而激活蛋白激酶B信號，為哮喘治療提供了新的可能靶點[8]。

LncRNA參與調控Th1和Th2 的平衡。Zhu等[9]對嗜酸性哮喘患者的外周血進行RNA測序，發現了差異表達的lncRNA。進一步研究顯示，lncRNA-000127在嗜酸性哮喘患者CD4+T細胞中特異性高表達，并通過調控GATA結合蛋白3通路進而促進Th2炎癥，提示lncRNA-000127可作為嗜酸性哮喘的生物標志物，靶向lncRNA-000127可能是治療嗜酸性哮喘Th2炎癥的有效手段。另有研究報道，哮喘患者血液中lncRNA-metastasis associated lung adenocarcinoma transcript 1(MALAT1)表達上調，miR-155表達下調，MALAT1通過海綿作用機制結合抑制CD4+T細胞中miR-155的表達，進而調控Th1/Th2的失衡[10]。

已有報道顯示，Th17/調節性T細胞(regulatory T cells，Treg)的失衡是參與哮喘發病的重要機制，像IL-17A、IL-17F、IL-22這些Th17型細胞因子的上調，以及Treg型細胞因子[如IL-10和轉化生長因子(TGF)-β]的下調能夠介導的中性粒細胞募集和氣道炎癥惡化。研究發現lncRNA對調節Th17/Treg的失調有重要作用。體內干擾及過表達實驗結果顯示lncRNA-maternally expressed 3(MEG3)可以上調Th17相關的促炎細胞因子(IL-17、IL-22)和維甲酸相關孤核受體γt(retinoid-related orphan nuclear receptor γt，RORγt)[11]，其機制為lncRNA-MEG3與miR-17結合，競爭性抑制miR-17與RORγt的結合來阻止RORγt mRNA的降解。提示lncRNA-MEG3/miR-17/RORγt軸可影響哮喘患者Th17/Treg平衡，該研究將為臨床治療提供有力依據。

另外，有研究者檢測了哮喘患者惡化期、緩解期以及健康志愿者血漿中細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑2A(INK4)位點lncRNA反義非編碼RNA(lncRNA-ANRIL)的表達。結果顯示與緩解期組或對照組相比，哮喘惡化期患者lncRNA-ANRIL表達顯著性升高，并且可以負調控miR-125a，結果提示ANRIL/miR-125a軸在哮喘的發病機制中發揮重要作用，lncRNA-ANRIL可能成為診斷哮喘惡化和氣道炎癥程度的重要指標[12]。另外，最新研究顯示[13]，lncRNA-nuclear paraspeckle assembly transcript 1(NEAT1)能夠與miR-124的相互作用，增加哮喘加重風險和嚴重程度，并和炎癥因子如腫瘤壞死因子TNF-α、IL-1β和 IL-17增加呈正相關。結果說明lncRNA-NEAT1可能作為哮喘風險評估以及嚴重程度的新靶標。還有研究發現，哮喘小鼠沉默lncRNA-AK085865，可通過調節巨噬細胞極化，抑制M2巨噬細胞進而減少2型先天淋巴細胞(group 2 innate lymphoid cells，ILC2)的數量，最終抑制哮喘炎癥[14]。除此之外，細胞因子IL-4、IgE等的表達也與lncRNA-brain cytoplasmic RNA 1(BCYRN1)有著明顯的正相關，哮喘患者的病情與lncRNA-BCYRN1的表達水平有著密切的相關性。

由此可見，lncRNAs能夠調控氣道重塑、Th1/Th2平衡以及Th17/Treg平衡等過程，進而影響過敏微環境，在過敏性哮喘的發生、發展和復發中發揮關鍵作用(Tab 1)。并且lncRNAs在過敏性哮喘中的作用機制多集中于和特異性miRNA的結合，從而調控miRNA的靶基因表達水平，這是很多lncRNAs基于ceRNA調控網絡的共同機制。但其差異在于不同的lncRNAs可能通過調控一個或多個miRNA從而改變靶基因的表達水平，最終影響不同的下游途徑，如ILC2細胞、Th2細胞以及Th17細胞等細胞因子的分泌。這對lncRNAs作用靶點的探尋，以及深入的具體機制探索具有提示意義，這些特異性的lncRNA還可以作為對病情風險預測、評估、預后和監測的一項重要指標。

3 lncRNA在過敏性鼻炎中的作用

過敏性鼻炎(allergic rhinitis，AR)是指在變應原刺激下，在鼻黏膜中誘導的炎癥反應。該炎癥反應過程包括IgE介導的肥大細胞脫顆粒，進而募集嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞和T細胞，進一步促進Th2細胞因子的分泌，如IL-4和IL-5，進一步促進了IgE的合成和嗜酸性粒細胞的增多。AR主要特征為鼻塞、瘙癢、鼻漏以及陣發性噴嚏，氣流阻塞等，該疾病影響著世界上大約30%的群眾，一般發生于兒童時期，是兒童最常見的慢性過敏性疾病。lncRNAs在調控Th2反應中的作用研究提示其可能在AR的發病機制中發揮重要作用。

有研究者對AR患者鼻黏膜中的lncRNA進行基因芯片檢測分析，發現其中有1 033個lncRNAs在鼻黏膜組織中高表達，有1 226個lncRNAs低表達。對lncRNA-mRNA共表達進行分析發現，這些差異表達的lncRNAs在AR發育相關的細胞信號通路中富集，例如能夠促進IL-13產生，正向調控免疫球蛋白受體FcεR-1和核因子κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)信號通路[15]。另外，對AR患者外周血進行基因芯片分析[16]，發現有31個lncRNA存在差異表達，通過qRT-PCR驗證，ENST00000445003.1、ENST00000456563.1 和ENST00000609268.1 在AR患者中顯著高于對照組。GO、Pathway和Disease分析表明，這3個lncRNA與炎癥、免疫反應和過敏性疾病方面富集的mRNA：色氨酰tRNA合成酶、調亡相關酪氨酸激酶、葡萄糖苷酶等密切相關。轉錄因子預測結果提示有機陽離子轉運蛋白、轉錄激活因子AP-1及NF-κB在lncRNAs介導的AR發病機制中發揮關鍵作用。

有研究報道，lncRNA-ANRIL的表達水平與TNF-α、2型細胞因子IL-4和IL-13呈正相關，與IL-10和IFN-γ水平呈負相關[17]，且lncRNA-ANRIL的表達與AR的患病風險、嚴重程度以及炎癥指標的增加呈正相關，提示其可作為AR的診斷指標。還有研究發現，阻斷組蛋白去乙酰化酶(HDAC)活性可能成為AR的一種新治療靶點，因為丁酸鈉能夠抑制HDAC，進而使lncRNA-NONMMUT057309表達下調，最終改變免疫球蛋白的表達。提示丁酸鈉可能通過調控lncRNA-NONMMUT057309的表達影響鼻黏膜的過敏反應[18]。研究者在AR患者的鼻組織和IL-13刺激的鼻上皮細胞中發現lncRNA-00632表達下調。并且lncRNA-00632能夠抑制IL-13誘導粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子，嗜酸性粒細胞趨化因子和粘蛋白的產生，其作用機制是lncRNA-00632靶向miR-498進而調控下游炎癥信號[19]。研究發現lncRNA-Forkhead box D3反義RNA1(lncRNA-FOXD3-AS1)在AR患者鼻黏膜中表達下調，抑制細胞中IL-25的分泌，從而減輕AR中Th2型免疫反應[20]。還有研究表明[21]，lncRNA-NEAT1及其靶點miR-21和miR-125a與AR患病風險、嚴重程度和炎癥密切相關。

這些研究顯示了不同的lncRNA在AR中的重要作用(Tab 1)，值得注意的是，lncRNA-ANRIL和lncRNA-NEAT1不僅在AR中過表達，在過敏性哮喘中也表達升高，雖然最終炎癥因子均表現出升高，但其作用機制不同，同一個lncRNA在不同的疾病中可能通過調控不同的靶點miRNA發揮作用。目前關于lncRNA在AR中的研究主要集中于臨床樣本，在臨床研究中發現不論是在鼻黏膜組織，還是在患者的外周血中，均存在lncRNAs的差異表達，這些差異表達明顯的lncRNAs通過調控炎癥因子發揮作用，其有可能成為AR評估的生物標志物或新靶點。但對于lncRNAs的機制研究尚不深入，仍需大量的動物實驗以及細胞實驗加以證明。

Tab 1 Expression and function of lncRNAs in allergic diseases

4 lncRNA在過敏性皮炎中的作用

特應性皮炎(atopic dermatitis，AD)以Th2細胞介導的異常炎癥反應和血清IgE和嗜酸性粒細胞升高為特征，并伴隨皮膚濕疹性皮膚破損和劇烈的瘙癢，AD患者更容易誘發其他過敏性疾病，很多患者在兒童時期患有AD，成年后對過敏原敏感性增加，其中有30%～60%患者伴隨過敏性鼻炎和哮喘[22]。因此AD的發病機制以及診療策略的研究不容忽視。

目前，關于非編碼RNA在AD中的研究，miRNA相對較多，其中lncRNA作為較新的領域，在AD中的作用研究較少，作者前期建立了異硫氰酸熒光素誘導的AD動物模型，利用基因芯片檢測了該模型中lncRNA的表達。在AD復發后，發現5 766個lncRNA調控異常。且有419個lncRNA在炎癥消退的緩解期仍然差異表達。進一步驗證發現lncRNA0016+，uc008thl.1，uc029qxr.1和AK077345表達顯著性上調。uc029ycn.1、ENSMUST00000164311和ENSMUST00000149791表達顯著性下調。并對這幾個具有顯著性差異的lncRNAs進行靶基因的預測分析以及ceRNA分析[23]。這些lncRNAs可能是調節小鼠特應性皮炎復發的潛在新靶點(Tab 1)，其具體作用機制值得深入研究。

5 lncRNA是潛在治療靶點

LncRNA在疾病中發揮著關鍵的作用，提示靶向干預特異性的lncRNA可能是治療疾病的有效手段。lncRNA具有高組織特異性以及對細胞網絡特定面的調節特點，以及其毒性作用弱等優勢。并且lncRNA缺乏翻譯過程，周轉快，較低的劑量即可發揮快速的效果。因此lncRNA作為潛在的干預靶點在臨床上備受關注。

目前，靶向lncRNA的治療方法主要基于反義寡核苷酸(antisense oligonucleotides，ASOs)的使用。ASOs本質上是單鏈的DNA寡核苷酸，根據序列同源性和RNA的可能性，能夠較快完成設計。并且ASO適用于靶向保留在細胞核中的lncRNA，這是因為ASO通過Watson-Crick堿基配對與目標RNA結合，并能在結合位點誘導核糖核酸酶H(RNase-H)介導的共轉錄裂解，導致過早轉錄終止，從而降低lncRNA水平。ASOs在細胞中有很高的療效，但在臨床使用中仍有一定局限性，主要是因為其在體內的毒性以及缺乏合適的傳遞系統，阻礙了足夠劑量的治療性ASOs對組織的靶向作用。為改善其藥理活性，學者們對ASOs進行了一定的化學修飾，如GapmeR ASOs、RNA-DNA-RNA單鏈寡核苷酸鏈。這些修飾可增強與靶RNA的雜交親和性，從而增加對核酸酶降解的抵抗力，并減少了非特異性免疫刺激活性。目前一些靶向mRNA的ASOs已經被FDA和歐洲藥物管理局批準或進入臨床試驗，一些靶向致癌lncRNA的ASOs也在開發中[24]。

另外，也有一些研究使用小分子靶向lncRNA，進而發揮作用。但想要獲得具有高親和力和特異性結合lncRNAs的分子，需要識別結構復雜的相關RNA序列[25]。且lncRNA經常折疊成幾個模塊結構域，其可能參與不同的分子相互作用，因此此方法存在一定局限性。針對lncRNAs在疾病中的治療和應用，有研究發現可以通過阻斷lncRNA和蛋白質之間的相互作用從而達到治療作用。還可通過采用模仿lncRNA結構和結合特性的合成分子競爭性與蛋白結合，從而干擾其功能。

除此之外，外泌體作為納米微泡，可將核酸、蛋白質運送到受體細胞。結合外泌體沒有腫瘤形成的風險，并且可以通過過濾消毒，很容易在體內循環并到達損傷部位且長期重復給藥外泌體不會引起毒性等優點。利用外泌體攜帶特異性的lncRNA類似物/抑制劑或可與lncRNA結合的分子，進行過敏性疾病的靶向治療可能是一種安全有效的手段，其具體作用和開發值得深入研究。

6 小結

在過去的幾十年里，由于環境變化和表觀遺傳修飾等原因，過敏性疾病的發病率呈現驚人的增長趨勢。目前臨床上常用的治療方式有糖皮質激素、抗組胺藥、免疫抑制劑等，其主要在于控制癥狀，不僅對過敏性疾病的反復發作束手無策且其副作用較大。尤其對于很多中度或重度患者，以及對糖皮質激素不敏感患者，目前臨床上缺乏較好的診療方案。因此對于過敏性疾病的防治研究一直是研究者關注的問題。雖然近年來對過敏原引起的免疫反應方面取得了一定進展，像一些生物制劑的開發使用，如靶向IL-4和IL-13信號的Dupilumab以及靶向胸腺基質淋巴細胞生成素(thymic stromal lymphopoietin，TSLP)的Tezepelumab，均顯現出治療優勢，但仍需多次給藥來發揮療效，且其安全性需要通過長期隨訪研究進一步證實。因此尋找新的替代治療方式和干預措施，為患者選擇最合適的藥物十分重要。

中醫藥在過敏性疾病的治療中存在明顯優勢，不僅副作用小，且對很多過敏性疾病的復發有抑制作用，像中藥玉屏風散、防風通圣散等均表現出能夠改善過敏微環境的特點。基于中藥對非編碼RNA的調控，揭示中藥的有效物質基礎，明確特異性靶點，對中藥的作用機制的明確具有重要意義。因此靶向非編碼RNA，包括miRNA或lncRNA是一種新的治療途徑，在臨床上具有優勢特征。因此評估特定lncRNA在過敏性疾病調控中的作用，以及lncRNA的靶基因及其參與調控的ceRNA網絡，將有助于識別過敏性疾病的生物標志物，并為lncRNA在過敏性疾病中機制的明確以及臨床新藥的開發和利用提供依據。