重建線粒體動態平衡對NK細胞NK2型活化影響

陳旭青，周龍云，史 軍，吳繼勇，于希忠，嚴芮雯，嚴道南，馬華安

(1.南京中醫藥大學附屬醫院耳鼻喉科，2.南京醫科大學第一附屬醫院康復醫學中心，江蘇 南京 210029；3.南京中醫藥大學第一臨床醫學院，江蘇 南京 210046)

自然殺傷(natural killer，NK)細胞為機體固有免疫系統的重要組成，其于不同微環境刺激下，呈現出的分化傾向不一[1]。IL-12可誘導其分化為NK1型細胞，其以CD45RO等表型特征，分泌INF-γ等細胞因子，以協調免疫應答。NK細胞NK2型分化，則可分泌大量IL-4、IL-5等Th2型細胞因子，介導變應性炎癥反應[2-3]。多項研究顯示，變應性疾病狀態下，NK細胞可向病變部位募集，并發生NK2主導型活化，促進局部Th2型細胞因子的表達[4-5]，即NK細胞NK2型活化與變應性疾病發展密切關聯。故探討NK細胞異常活化機制，調控其功能紊亂，對變應性疾病的治療具有重要價值。

線粒體為調控細胞各項生命活動的動力元件，其通過頻繁融合、分裂動態變化維持內部功能穩態[6-7]。這一動態平衡機制涉及多種蛋白，其中Drp1為調控線粒體分裂的關鍵分子。細胞內Drp1過度活化，可于線粒體外膜大量募集，通過壓縮外膜加速線粒體分裂，并觸發活性氧(reactive oxygen species，ROS)大量內生，以此調控Ca2+穩態、吞噬、炎癥反應、凋亡等細胞諸多生命活動[6]。近年研究顯示，NK細胞NK2型活化伴隨著線粒體動態變化的失衡，存在線粒體過度分裂現象[8]，但兩者內在關聯尚不明確。基于此，本研究擬以線粒體分裂抑制劑Mdivi-1，探討重建NK細胞線粒體動態平衡對NK細胞異常活化的影響，并揭示NK細胞異常活化的內在機制。

1 材料

1.1 主要儀器Herocell 180型CO2培養箱(美國Thermo公司)、ELX800型酶標儀(美國BioTek)、ChemiDoc XRS型化學發光凝膠成像儀、Accuri C6 型細胞儀(美國BD)、Lecia DMI 3000B型倒置熒光顯微鏡(德國Leica公司)、Lecia SP8型激光共聚焦顯微鏡(德國Leica公司)。

1.2 主要藥品與試劑線粒體分裂抑制劑1(mitochondrial division inhibitor，Mdivi-1,M0199)購自美國Sigma-Aldrich公司，重組人胸腺基質淋巴細胞生成素(thymus stromal lymphopoietin，TSLP，300-62)購自美國PeproTech公司，α-MEM培養基(11900024)、馬血清(16050122)、胎牛血清(10100147)、巰基乙醇(614272)購自美國Gibco公司，肌醇(A600536)、葉酸(A610466)、磷酸鹽(phosphate buffer saline，PBS)緩沖液粉末(B040100)購自生工生物工程股份有限公司，ROS檢測熒光探針-二氫乙啶(dihydroethidium，DHE)試劑盒(KGAF019)購自南京凱基生物科技發展有限公司，MitoTracker Green(40742ES50)購自上海翊圣生物科技有限公司、牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA，ST025)、BCA蛋白定量試劑盒(P0012)購自上海碧云天生物技術有限公司，PVDF膜(IPVH00010)購自美國Millipore公司，IL-4(70-EK104-96)、IL-5(70-EK105-96)、IFN-γ(70-EK180-48)酶聯免疫吸附測定(ELISA)試劑盒均購自杭州聯科生物技術股份有限公司，MnSOD兔多克隆抗體(ab13534)、Drp1兔單克隆抗體(ab184247)、β-actin兔多克隆抗體(ab8227)均購自英國Abcam公司，p-Drp1兔多克隆抗體(3455S)購自美國CST公司，HRP標記山羊抗兔IgG(A0208)購自上海碧云天生物技術有限公司。

1.3 實驗細胞人惡性非霍奇金淋巴瘤患者的自然殺傷細胞(NK-92MI，GOY-ATCC-0016)購自上海谷研實業有限公司。以含12.5%胎牛血清、12.5%馬血清、0.2 mmol·L-1肌醇、0.1 mmol·L-1巰基乙醇、0.02 mmol·L-1葉酸的α-MEM培養基，于37 ℃ CO2培養箱中培養。

2 方法

2.1 實驗分組NK-92MI細胞分為空白組、TSLP組、1 μmol·L-1Mdivi-1組、5 μmol·L-1Mdivi-1組、10 μmol·L-1Mdivi-1組。TLPS組細胞以20 μg·L-1TSLP刺激24 h，誘導NK細胞NK2分化。Mdivi-1組以20 μg·L-1TSLP聯合相應濃度Mdivi-1孵育24 h。

2.2 上清細胞因子分析回收各組細胞上清，于500×g，4 ℃條件下離心10 min，獲取上清。據ELISA試劑盒說明書，經標準樣、待測樣加樣，震蕩、洗滌，檢測抗體、HRP標記的鏈霉親和素、底物孵育后，以酶標儀進行雙波長掃描，測定各組上清IL-4、IL-5、IFN-γ水平。

2.3 蛋白印跡分析回收細胞樣本，經裂解、勻漿、靜置、離心后，獲取蛋白上清。BCA法測定蛋白濃度，調整終濃度，高溫變性后-80 ℃凍存備用。取蛋白樣品經SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳并轉移至PVDF膜上，5% BSA的TBST室溫封閉后，分別加入以1% BSA稀釋的IL-4、IFN-γ、p-JAK2、JAK2、p-STAT6、STAT6、β-actin抗體，4 ℃孵育過夜。次日孵育HRP標記山羊抗兔IgG。滴加ECL曝光液，以Bio-rad化學發光檢測儀顯影，拍照保存。圖像以ImageJ軟件分析。

2.4 細胞ROS檢測離心收集處理后細胞，以含25 μmol·L-1DHE的α-MEM培養基重懸，CO2培養箱中孵育1 h。離心，PBS洗滌，棄上清。500 μL PBS重懸，Accuri C6流式細胞儀檢測熒光強度。

2.5 線粒體形態觀察離心收集處理后細胞，以含37 ℃預熱的100 nmol·L-1MitoTracker Green α-MEM培養基，于CO2培養箱中孵育30 min。離心，PBS洗滌，棄上清。α-MEM培養基重懸，接種于激光共聚焦皿，激光共聚焦顯微鏡下拍照。

3 結果

3.1 Mdivi-1對NK-92MI細胞上清IL-4、IL-5、IFN-γ 水平的影響NK細胞NK2型活化以表達、分泌IL-4、IL-5因子為特征，而IFN-γ則為NK細胞NK1活化標志性因子。如Fig 1所示，與對照組比較，TSLP組NK-92MI細胞上清中IL-4、IL-5水平明顯升高，IFN-γ水平下調，差異具有統計學意義(P<0.05)。與TSLP組比較，5、10 μmol·L-1Mdivi-1組細胞上清IL-4、IL-5水平降低，10 μmol·L-1Mdivi-1組IFN-γ濃度則有所回升，差異具有統計學意義(P<0.05)。

3.2 Mdivi-1對NK-92MI細胞內生ROS的影響ROS為諸多變應性疾病的重要病理信號，調控著NK細胞功能狀態[9-10]。如Fig 2、3所示，與對照組比較，TSLP組NK-92MI細胞ROS水平明顯升高，差異具有統計學意義(P<0.05)。與TSLP組對比，5、10 μmol·L-1Mdivi-1組ROS水平降低，差異具有統計學意義(P<0.05)。

3.3 Mdivi-1對NK-92MI細胞線粒體形態的影響線粒體過度分裂可觸發ROS大量生成，為變應性炎癥、免疫細胞功能紊亂的重要因素[6,11]。如Fig 4所示，對照組NK-92MI細胞內線粒體主要呈長管狀，散布于胞質。TSLP刺激后，NK-92MI細胞內大量圓球狀線粒體生成。而Mdivi-1干預后，有效減少了TSLP刺激下球狀線粒體的生成。

3.4 Mdivi-1對NK-92MI細胞Drp活化、MnSOD表達的影響Drp1為調控線粒體分裂的關鍵因子，線粒體功能的紊亂伴隨著氧化應激防御因子MnSOD表達的下調[7,12]。如Fig 5所示，與對照組比較，TSLP組NK-92MI細胞p-Drp1水平明顯上調，而MnSOD表達下降，差異具有統計學意義(P<0.05)。而Mdivi-1干預后，有效逆轉了上述分子表達變化，且該效應隨著藥物劑量上調呈增強趨勢。

Fig 1 Levels of IL-4,IL-5 and IFN-γ in supernatant of each group n=3 )*P<0.05,**P<0.01 vs control group;#P<0.05,##P<0.01 vs TSLP group.

Fig 2 DHE staining of NK-92MI cells in each group n=3 )A：Control;B:TSLP;C:1 μmol·L-1 Mdivi-1;D:5 μmol·L-1 Mdivi-1;E:10 μmol·L-1 Mdivi-1;Scale bar=100 μm

Fig 3 Flow cytometric quantitative analysis of DHE staining of NK-92MI cells in each group n=4 )**P<0.01 vs control group;##P<0.01 vs TSLP group.

Fig 4 Mitochondrial morphology of each group by confocal fluorescence microscopy n=5 )**P<0.01 vs control group;##P<0.01 vs TSLP group.Scale bar=10 μm.

Fig 5 Expression of p-Drp1 and MnSOD A:Electrophoretogram of p-Drp1 and MnSOD in each group.B:Quantitative analysis of p-Drp1 and MnSOD expression.**P<0.01 vs control group;#P<0.05,##P<0.01 vs TSLP group.

4 討論

線粒體為高度動態的網管狀細胞器，其動態平衡機制調節著細胞系列生命活動，而與多種生理病理變化密切關聯[6-7]。NK細胞是參與機體腫瘤免疫、變態反應等活動的重要細胞[5]。近年研究示，NK細胞功能紊亂，常伴隨著線粒體功能的失常，以及線粒體過度分裂現象[8,13]。然而粒體功能與NK細胞狀態間是否存在關聯尚不明確。本研究則立于“線粒體功能紊亂-細胞異常活化”這一視角，探討NK細胞NK2 活化的內部機理，為NK細胞異常活化機制及潛在干預靶點這一研究盲區提供參考。

NK細胞NK2型活化，釋放IL-4、IL-5、IL-10等細胞因子，介導變應性炎癥反應，參與變應性鼻炎、特應性皮炎、哮喘等疾病的發生發展[2,14]。TSLP可有效誘導T細胞Th2型分化、NK細胞NK2活化，為加劇體內外變應性炎癥反應的重要分子[15]。研究顯示，TSLP刺激后，NK-92MI細胞上清中IL-4、IL-5水平顯著升高，IFN-γ水平下調，符合NK細胞NK2型活化表征。而5、10 μmol·L-1Mdivi-1干預后，細胞上清IL-4、IL-5水平下調，IFN-γ 濃度亦有所回升，提示Mdivi-1能有效抑制TSLP刺激所誘導的NK細胞Th2反應相關因子的分泌。

Mdivi-1為調節Drp1活性以特異性逆轉線粒體分裂事件的化學分子[16]。近年來，Mdivi-1已廣泛運用于線粒體動態變化與腫瘤、神經退行性、心血管疾病等關聯的探索之中[16-17]。線粒體熒光探針MitoTracker染色示，TSLP刺激后，大量球狀線粒體分布于NK細胞胞質內，提示線粒體分裂亢進，這一現象與其他其他文獻報道相符[6,8]。而Mdivi-1干預后，TSLP誘導下NK細胞線粒體過度分裂現象得到顯著改善，其線粒體長度亦有所回歸。蛋白印跡分析示，Mdivi-1干預可有效抑制NK細胞異常活化狀態下線粒體分裂調控因子Drp1的活化。提示Mdivi-1抗NK細胞NK2型活化作用可能與其抑制線粒體過度分裂，重建線粒體動態平衡相關。

線粒體過度分裂可觸發大量內生ROS的生成[6]，而后者與T、B、NK細胞等異常活化密切關聯[9,18]。DHE染色及流式分析顯示，TSLP刺激下NK細胞內生ROS水平明顯升高。而Mdivi-1干預則能有效下調TSLP刺激下NK細胞ROS內生，且該效應與Mdivi-1濃度呈正相關態勢。同時，蛋白印跡分析亦顯示，TSLP刺激下NK細胞MnSOD這一氧化應激防御因子表達的下調，亦于Mdivi-1干預后得到一定程度逆轉。綜上，Mdivi-1調節NK細胞ROS水平，可能是其抑制線粒體分裂以改善NK細胞NK2型活化的效應環節之一。

本次試驗存在一些問題：(1)鑒于原代NK細胞培養難度較大，本研究以NK92MI細胞株作為實驗對象，研究結果可能存在一定偏倚；(2)本研究未能選擇Drp1基因沉默技術調節線粒體分裂，從抑制劑及基因敲降兩個層面同步驗證實驗結果；(3)Mdivi-1抑制線粒體分裂后，具體通過哪些分子機制鏈影響NK細胞分化未進一步深入探索，這是我們下一步研究的重要方向。

綜上，通過Mdivi-1抑制線粒體過度分裂，重建線粒體動態變化，可有效抑制TSLP刺激下NK細胞NK2型活化。線粒體動態失衡是NK細胞異常活化的內在機制之一，其可能為改善NK細胞NK2型活化介導的變應性炎癥反應的重要靶點。