紅景天苷激活HIF-1α信號通路促進成骨細胞增殖的機制

金昱彤，祁 琳，牛芯蕊，王繼達，于 爽，李佳穎，邊育紅，王 越

(1.天津中醫藥大學中西醫結合學院，天津 301617；2.武警特色醫學中心藥劑科，天津 300162)

成骨細胞調控的骨形成環節與破骨細胞調控的骨吸收環節發揮協同作用，共同維持著骨穩態，與骨流失相關的骨骼疾病，如骨質疏松，是由于成骨細胞的功能受損，進而骨穩態失衡造成[1]。成骨細胞骨形成功能的低下可加速骨吸收作用，導致骨穩態失衡，降低骨密度，增加骨脆性，從而引發骨質疏松[2]。因此，使用有效的藥物促進成骨細胞增殖并提高骨形成能力是治療骨質疏松病的關鍵。

中藥紅景天系景天科大花紅景天的干燥根莖，具有益氣活血的功效。其中，紅景天苷(salidroside，SAL)是紅景天中的主要有效活性成分，有低毒性和低副作用的特性。近年來，因其具有抗缺氧、抗骨質疏松、神經保護及抗癌等藥理學作用而受到廣泛關注[3-4]。在抗骨質疏松研究方面，SAL能夠促進成骨細胞增殖，同時抑制成骨細胞的氧化損傷及骨吸收因子的釋放從而減少骨量的丟失[5]。最新研究表明，SAL通過激活Wnt/BMP 信號通路促進成骨細胞分化，從而起到抗骨質疏松的作用[6]。

缺氧誘導因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)與促進骨形成、血管新生，改善骨折愈合有著密切關系[7]。血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、血管生成素樣蛋白4(angiopoietin-like protein 4，ANGPTL4)及白介素6 (interleukin 6，IL-6)均為HIF-1α的下游靶基因，具有促進成骨細胞增殖和骨血管生成的作用[8-10]。我們在前期研究中發現，SAL可通過HIF-1α/VEGF信號通路促進骨折愈合，促進小鼠骨形成功能[11]。本研究以小鼠原代細胞(mouse primary osteoblasts，MOB)為研究對象，進一步探究SAL促進成骨細胞增殖的作用機制。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑紅景天苷(純度≥98%，N11O9X71936)購于上海源葉生物有限公司；YC-1(81560)購于Cayman Chemica公司；胰酶(T1320)、Ⅰ型膠原酶(C8140)、ALP染色試劑盒(G1481)均購于Solarbio公司；α-MEM培養基(SH30265.01)購于Hyclone公司；胎牛血清(S711-001S)購于Lonsera公司；青鏈霉素(15140-122)購于Gibco公司；BCA蛋白定量試劑盒(CW00145)、HiFi Script cDNA Synthesis Kit(CW2569M)均購于康為世紀生物科技有限公司；HIF-1α抗體(ab2185，1 ∶1 000)、GAPDH抗體(ab181602，1 ∶10 000)均購于Abcam公司；TransStart TopGreen qPCR SuperMix(AQ601-03)購于北京全式金生物技術有限公司；HIF-1α、VEGF、ANGPTL4 、IL-6mRNA引物均購于北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司；VEGF(YX-220513M)、ANGPTL4(YX-011407M)、IL-6(YX-091206M)ELISA試劑盒購于天津伊特生命科學研發有限公司

1.2 主要儀器超凈工作臺，Heal Force公司；CO2培養箱、酶標儀Thermo公司；倒置顯微鏡，NIKON公司。

1.3 實驗動物新生48 h內的C57/BL6乳鼠10只，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司,許可證號SCXK(京)2016-0006。

2 方法

2.1 原代成骨細胞的提取將新生乳鼠用酒精浸泡消毒后，在超凈工作臺內剝離出顱蓋骨，置于含青鏈霉素的PBS中，剔除組織后剪碎并置于新的培養瓶中。采用胰酶-Ⅰ型膠原酶聯合消化剪碎的骨片，收集膠原酶消化液離心后收集細胞沉淀，在37 ℃、5% CO2培養箱中培養，差速貼壁法純化提取的MOB，取2～5代細胞進行后續實驗。

2.2 原代成骨細胞的鑒定將第2代原代成骨細胞PBS漂洗兩次后，用4%細胞固定液固定30 min，配制ALP染色溶液并依次加入，在37 ℃恒溫孵育箱避光孵育60 min，PBS漂洗后顯微鏡下觀察。

2.3 MTT檢測細胞增殖情況使用MTT法檢測細胞增殖情況，調整MOB細胞濃度后接種于96孔板中，每個濃度SAL設置5個復孔。分別培養24、48和72 h，酶標儀檢測490 nm波長各孔OD值。

2.4 Western blot檢測用Western blot法檢測在加入1～1 000 nmol·L-1SAL后細胞中關鍵蛋白HIF-1α的表達變化，按說明書比例配制含PMSF的RIPA裂解液，冰上裂解后按BCA蛋白定量試劑盒說明書測定樣品濃度。隨后進行SDS-PAGE電泳、轉膜，封閉孵育后顯影，用ImageJ分析條帶，使用GraphPad Prism8作圖。

Tab 1 List of primers

2.5 RT-PCR檢測使用TRIzol提取法提取Control組和SAL干預組(1、10、100、1 000 nmol·L-1)細胞總RNA，檢測濃度后進行逆轉錄反應。隨后使用SYBR qPCR SuperMix進行熒光定量PCR，實驗每組設置3個復孔，采用相對定量法分析，運用2-ΔΔCT的方法進行數據統計。

2.6 ELISA檢測收集Control組及SAL干預組(1、10、100、1 000 nmol·L-1)的細胞上清液，按照ELISA試劑盒說明書步驟制備標準曲線，依次加入樣品，每個樣品設置3個復孔，使用酶標儀檢測OD值，檢測上清液中VEGF、ANGPTL4及IL-6的水平情況。

2.7 藥物干預與分組取正常培養的2-5代MOB，分Control組，SAL干預組(1、10 、100、1 000 nmol·L-1)，SAL干預組給予SAL處理48 h，Control組采用α-MEM完全培養基對照，加入HIF-1α阻斷劑YC-1(10 μmol·L-1)，預處理1 h。

3 結果

3.1 原代成骨細胞的培養將提取后的MOB于24 h、72 h和5 d在鏡下觀察，可見提取后24 h的成骨細胞貼壁生長、胞核呈卵圓形，72 h時形態呈現為梭形，且細胞之間接觸增多、胞體向外伸展，5 d后細胞形態多呈三角樣、紡錘樣，待長滿培養瓶進行傳代培養。

3.3 SAL對小鼠原代成骨細胞增殖的影響使用不同濃度(1、10、100、1 000 nmol·L-1)的SAL分別作用MOB 24、48和72 h后，采用MTT法檢測在3個時間節點時SAL對MOB增殖的影響。結果如Fig 3所示，與Control組相比，24、48和72 h時SAL干預組均促進MOB的增殖，其中48 h開始增殖效果明顯，以100 nmol·L-1的SAL增殖效果最佳(P<0.01)。因此，后續實驗SAL濃度選擇1～1 000 nmol·L-1，并選用48 h為藥物作用時間。

Fig 1 Adherent primary osteoblasts in different growth stages

Fig 2 Alkaline phosphatase staining of second passage of MOB(100×)

Fig 3 Effects of SAL on proliferation of MOB

3.4 SAL對原代成骨細胞HIF-1α通路相關基因表達的影響為考察SAL對MOB中HIF-1α信號通路的影響，采用RT-PCR法檢測HIF-1α及通路中相關基因VEGF、ANGPTL4及IL-6表達水平的變化。結果如Fig 4所示，在加入SAL干預MOB后，與Control組相比，SAL干預組HIF-1α、VEGF、ANGPTL4及IL-6 mRNA表達均有不同程度上調，其中100 nmol·L-1的SAL干預組最明顯(P<0.01)。實驗結果提示，SAL可能經HIF-1α/VEGF、ANGPTL4、IL-6信號通路調控成骨細胞。

Fig 4 Effects of SAL on HIF-1α,VEGF,ANGPTL4,IL-6

3.5 SAL對HIF-1α通路相關蛋白表達的影響為進一步驗證SAL對成骨細胞HIF-1α通路關鍵蛋白表達的影響，采用Western blot法檢測了在加入SAL后HIF-1α蛋白表達的變化。結果如Fig 5顯示，與Control組相比，SAL干預組HIF-1α蛋白表達水平上調，且當SAL濃度為100 nmol·L-1時最為明顯(P<0.01)。在加入濃度為1～1 000 nmol·L-1的SAL后，使用ELISA法對上清液中的VEGF、ANGPTL4、IL-6檢測結果顯示，與Control組相比，SAL干預組VEGF、ANGPTL4及IL-6的分泌含量均有不同程度增加。

3.6 HIF-1α阻斷劑YC-1對SAL作用后HIF-1α通路相關蛋白表達的影響在加入SAL前使用HIF-1α阻斷劑YC-1提前處理MOB 1 h，選用100 nmol·L-1濃度的SAL同時設立阻斷劑對照組，檢測HIF-1α及VEGF、ANGPTL4及IL-6的蛋白表達情況。實驗結果如Fig 6顯示，與Control組相比，YC-1對相關蛋白表達無明顯影響，在加入100 nmol·L-1SAL后蛋白表達顯著上調(P<0.01)。與SAL干預組相比，YC-1+SAL組HIF-1α、VEGF、ANGPTL4及IL-6的蛋白表達均下調，由此可見SAL對MOB的作用有部分經HIF-1α/VEGF、ANGPTL4、IL-6信號通路調控。

Fig 5 Effect of SAL on protein expression level of HIF-1α,*P<0.05,**P<0.01 vs control group

Fig 6 Effects of YC-1 on protein expression level of HIF-1α,*P<0.05,**P<0.01 vs control group；#P<0.05，##P<0.01 vs SAL group

4 討論

骨質疏松癥是一種由骨穩態失衡導致的慢性疾病，尤以老年人和絕經后婦女為高風險發病人群[12]，與年齡相關的骨質流失和骨質疏松病與成骨細胞數量減少密切相關。成骨細胞來源于骨間充質干細胞，主要功能為調控骨基質的合成、分泌和礦化[13]。成骨細胞骨形成功能的低下可加速骨質流失，而促進骨形成的重要靶點在于提高對成骨細胞增殖與分化功能的調控。

HIF-1是調節細胞內氧穩態的核心轉錄因子，其組成包括α和β兩個亞基，HIF-1α信號通路與促進成骨細胞骨形成功能密切相關，激活HIF-1a和骨生成相關基因可改善骨折愈合、增加骨礦物質密度并增加骨強度[14]，小鼠骨形成能力隨著特異性敲除成骨細胞HIF-1α基因后顯著減弱[15]。有研究通過建立兩階段細胞譜系數學模型的方法分析HIF-1α對MSCs成骨分化的影響，結果顯示，HIF-1α對MSCs的成骨分化率具有劑量依賴性刺激作用[16]。

現有研究表明，VEGF、ANGPTL4和IL-6均為HIF-1α的下游靶基因，具有促進成骨細胞增殖和骨血管生成的作用。VEGF是促進骨血管生成的因子，成骨細胞中HIF-1α/VEGF信號通路的激活，可促進成骨細胞的增殖、加速血管生成，對骨折的治療起關鍵作用[8,17]。ANGPTL4是一種多功能脂肪因子，參與血管生成。Knowles等[9]應用DNA芯片分析發現ANGPTL4為HIF-1α下游的首要靶基因，且證實ANGPTL4可增強成骨細胞的增殖和分化。IL-6是由多種細胞產生的多功能細胞因子，HIF-1α過表達可顯著提高成骨細胞中IL-6的水平，外源性IL-6可以顯著促進成骨細胞的增殖，提示成骨細胞中的IL-6為HIF-1α下游靶基因，并通過HIF-1α途徑促進血管生成-成骨耦聯[10]。

本實驗選用源于MOB作為研究對象，提取時采用酶消化去除大部分存在于骨膜中的軟骨細胞。通過傳代和差異性貼壁法對提取的細胞進行純化后，成骨細胞為貼壁細胞的主要組成部分。通過MTT實驗檢測了不同濃度SAL(1～105nmol·L-1)對MOB的增殖作用，結果顯示在加入SAL(1～104nmol·L-1)24、48及72 h后可不同程度地促進MOB增殖，以100 nmol·L-1的SAL增殖效果最佳。進一步采用RT-PCR、Western blot、ELISA實驗檢測SAL對HIF-1α/VEGF、ANGPTL4、IL-6信號通路基因和蛋白表達的影響，結果表明在加入SAL(1～1 000 nmol·L-1)后相關基因與蛋白的表達均有不同程度的上調，在加入HIF-1α阻斷劑YC-1后該作用減弱，表明SAL對MOB的作用有部分經過HIF-1α/VEGF、ANGPTL4、IL-6信號通路調控。

綜上所述，SAL可促進MOB的增殖，其作用機制可能是激活HIF-1α/VEGF、ANGPTL4、IL-6信號通路，促進血管生成-成骨耦聯從而提高成骨細胞的增殖活性。本研究初步探索了SAL促進成骨細胞增殖及其作用機制，以期為SAL臨床抗骨質疏松用藥提供實驗依據，為中藥在臨床中防治骨質疏松提供了理論基礎和思路。