TRPV1/SIRT1介導吳茱萸次堿抗Ang Ⅱ誘導的血管平滑肌細胞衰老

余艷榮，汪小英，祝思路，王寒霞，彭維杰,4，羅 丹

(1.南昌大學基礎醫學院生理學系，2.南昌大學藥學院基礎藥理重點實驗室，江西 南昌 330006;3.阜陽市人民醫院藥劑科，安徽阜陽 236000；4.贛南醫學院，醫用組織工程材料與于生物制造江西省重點實驗室，江西 贛州 341000)

血管老化是高血壓、動脈粥樣硬化等心血管疾病發生、發展的重要病理改變，表現為血管結構和功能的改變，包括動脈內中膜厚度增加，順應性降低和血管炎癥表現。血管老化與構成血管壁的細胞衰老有關，其中衰老的血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)出現遷移、表型轉變等功能紊亂，并向成骨樣細胞分化而加速血管鈣化。大量研究發現，血管緊張素Ⅱ(Ang Ⅱ)，作為腎素血管緊張素系統的關鍵分子，在高血壓、年齡等多種因素誘導的血管老化中起到關鍵作用。老年人和老齡動物的動脈血管壁及VSMCs中Ang Ⅱ顯著增高，而Ang Ⅱ長期刺激可激活衰老通路p53/p21，誘導VSMC出現應激性早衰[1]。

SIRT1(sirtuin1)是一種依賴于NAD+的去乙酰化酶，參與調控細胞內各種代謝活動，尤其和細胞衰老密切相關，被稱為長壽蛋白[2]。檢測不同年齡人體血管發現，血管平滑肌中SIRT1水平隨年齡增長而顯著降低，伴隨血管平滑肌功能的改變，提示年齡相關的SIRT1水平下降導致VSMC衰老及功能失調[3]。此外，Ang Ⅱ引起的高血壓小鼠血管壁SIRT1水平下降，發生動脈斑塊區域的SIRT1表達也較對應正常區域下降[4]。而用藥物或基因手段上調SIRT1水平則可明顯抑制Ang Ⅱ、高糖和動脈粥樣硬化等因素誘導的VSMC衰老和功能紊亂[5]。因而，SIRT1被認為是抑制VSMC衰老和血管老化的熱門靶點。

吳茱萸次堿(rutaecarpine，Rut)是中藥吳茱萸中的主要活性物質，具有顯著的心血管保護效應，其舒血管和降壓作用已被廣泛研究[6]。我們和其他學者的前期研究表明，Rut可顯著抑制Ang Ⅱ引起的VSMC增殖和表型轉換，并減輕高血壓導致的血管重構[7]。Zhou等[8]報道，在高血壓動物模型中，Rut可降低其內皮祖細胞的衰老，且抑制Ang Ⅱ引起的內皮祖細胞衰老，表明Rut具有潛在的抗細胞衰老作用。大量證據表明，Rut的主要心血管效應均與激活瞬時受體電位香草酸亞型1 (transient receptor potential vanillic acid subtype 1，TRPV1)有關，后者廣泛存在于心血管系統，VSMC也能表達TRPV1。在Ox-LDL引起的VSMC源性泡沫細胞發現，TRPV1激動劑辣椒素可上調SIRT1的水平，提示TRPV1參與調節SIRT1表達[9]。因而本研究進一步在血管緊張素Ⅱ誘導的VSMC衰老模型中，探討Rut的保護作用，并研究其信號通路是否與TRPV1/SIRT1途徑有關。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑Rut(上海君拓生物技術有限公司)，Ang Ⅱ、TRPV1抑制劑CAPZ(Sigma,USA)，AMPK抑制劑Compound C(Selleck,USA)，β-半乳糖苷酶和活性氧檢測試劑盒(江蘇碧云天生物有限公司)，SIRT1抗體，p-AMPK抗體和AMPK抗體(Cell Signaling,USA)，p21抗體(ABclonal)，p53抗體(Proteintech)和山羊抗兔/小鼠IgG二抗(武漢BOSTER)；BCA蛋白定量試劑盒，Transwell 小室(3422)(Costor,USA)

1.2 儀器電泳儀和自動曝光儀(BIO-RAD，USA)，熒光顯微鏡(Olympus,日本)。

1.3 實驗分組取出大鼠胸主動脈，組織塊貼壁法原代培養VSMCs，傳代后取第3～8代用于實驗。實驗分組如下：① Control組：正常對照組；② Ang Ⅱ誘導衰老組：加入終濃度為1 μmol·L-1Ang Ⅱ孵育VSMCs 72 h；③-⑤不同劑量的Rut保護組：加入的終濃度分別為0.3、1和3 μmol·L-1的Rut孵育VSMCs 10 min后，加入Ang Ⅱ繼續孵育72 h；⑥ +CAPZ+Rut組：TRPV1受體阻斷劑CAPZ(10 μmol·L-1)預處理細胞10 min后，再加入3 μmol·L-1Rut孵育10 min，最后加入Ang Ⅱ繼續孵育72 h。⑦ +Compound C+Rut組：在加入Rut和Ang Ⅱ前，預先加入AMPK阻斷劑1 μmol · L-1Compound C孵育VSMC 10 min。

1.4 β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色法測定衰老細胞數目細胞衰老時會生成大量的β-半乳糖苷酶，該酶作用于底物X-Gal后，細胞會生成一種藍色物質。VSMC用Ang Ⅱ 誘導培養3 d后，去上清，各孔分別加入1 mL染色固定液15 min。吸棄染色固定液，用PBS洗3次。加入染色工作液封口膜密封，避光37 ℃烘箱過夜。顯微鏡下觀察拍照，ImageJ軟件算出衰老藍染的細胞數。

1.5 熒光探針法檢測細胞內ROS水平熒光探針DCFH-DA自身無熒光，但可自由穿過細胞膜后轉化為DCFH，后者可被細胞內的ROS氧化，生成發綠色熒光的DCF，從而間接計算出細胞內的ROS含量。細胞處理結束后，去上清，PBS洗2次。加入1 ∶1 000的DCFH-DA探針，用錫箔紙包裹6孔板，37 ℃避光孵育。0.5 h后用無菌的PBS洗2次，加入1 mL DMEM，鏡下進行觀察拍照，ImageJ算出熒光量。

1.6 劃痕愈合實驗測定細胞遷移細胞以2×105/孔的密度種于24孔板，待細胞長至100%后，用滅菌的Tips頭進行劃線，洗掉被破壞的細胞，再加入serum-free的培養基和對應藥物，在各個時間點(0、12、24 h)觀察同部位劃痕愈合情況。用ImageJ計算細胞的平均劃痕寬度，以反映細胞遷移狀況。細胞遷移率/%=(0 h劃痕寬度-24 h后劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%。

1.7 Transwell遷移實驗對數生長期的VSMCs消化后，含1%血清的培養液重懸，調整細胞密度為5×108L-1，在小室(8 μm)的每孔上室加入100 μL細胞懸液，下室加入400 μL 含有1%血清的培養液；將加有細胞的小室放置于孵育箱繼續培養24 h后，棄上室的培養基，用PBS洗滌3次，4%多聚甲醛固定20 min；然后加入1%結晶紫染色液，37 ℃染色30 min；PBS洗滌2～3次，在顯微鏡下拍照。每組細胞均設3個重復孔，每孔隨機取 6個視野進行拍照。

1.8 Western blot檢測VSMCs中SIRT1、p53、p21及p-AMPK蛋白表達細胞裂解提蛋白，BCA法蛋白定量。SDS-PAGE電泳、轉膜、8%的脫脂牛奶封閉2 h，結合一抗(1 ∶1 000)，4 ℃孵育過夜。洗膜，結合二抗(1 ∶5 000)，室溫孵育2 h。洗膜，ECL化學發光于曝光儀下檢測。使用ImageJ軟件分析條帶灰度，以β-actin為內參計算目的條帶的相對表達量。

2 結果

2.1 吳茱萸次堿對Ang Ⅱ 誘導的血管平滑肌細胞衰老和ROS生成的影響SA-β-Gal染色顯示(Fig 1A和C)，1 μmol·L-1Ang Ⅱ處理細胞72 h可明顯增加衰老陽性染色(藍染)細胞數量(P<0.01)，不同劑量的Rut能劑量依賴性地降低衰老染色細胞數量，其中3 μmol·L-1Rut的效果最為明顯(P<0.01)，CAPZ可消除Rut這一作用(P<0.01)。ROS結果表明(Fig 1B和D)，與對照組相比，Ang Ⅱ顯著性地升高細胞內ROS水平，不同劑量的Rut呈劑量依賴性地減少ROS產生，且提前加入CAPZ可消除Rut這一作用(P<0.01)。

2.2 吳茱萸次堿對Ang Ⅱ誘導的血管平滑肌細胞遷移的影響Transwell結果顯示，與Con組相比，1 μmol·L-1Ang Ⅱ可明顯增加遷移到小室對側的VSMC細胞數目(P<0.01)，Rut可劑量依賴性抑制Ang Ⅱ引起的VSMCs遷移(P<0.01)，預先加入CAPZ可消除Rut的作用(P<0.01)。劃痕愈合實驗也證實，劃痕24 h后Ang Ⅱ組細胞的劃痕距離明顯減小(P<0.01)，而加入不同劑量的Rut后細胞劃痕距離依次增寬，CAPZ可消除Rut的效應(P<0.01)，見Fig 2。

2.3 Rut對VSMC中長壽蛋白SIRT1及下游衰老通路p53/p21的影響Western blot結果表示，1 μmol·L-1Ang Ⅱ孵育VSMCs 72 h可顯著降低SIRT1的表達，同時使p53和p21的表達升高(P<0.01)。不同劑量的Rut呈劑量依賴性恢復SIRT1的表達，并抑制Ang Ⅱ誘導的p53和p21表達上調，高劑量Rut(3 μmol·L-1)效果最明顯(P<0.01)。提前加入CAPZ可消除或削弱Rut對這些蛋白的調節效應，見Fig 3。

Fig 1 Rut inhibited premature senescence of VSMCs and ROS production induced by Ang n=6)**P<0.01 vs control group;#P<0.05,##P<0.01 vs Ang Ⅱ group;++P<0.01 vs Ang Ⅱ+ Rut (3 μmol·L-1)group.

2.4 TRPV1/AMPK通路介導吳茱萸次堿上調SIRT1表達的作用如Fig 4A和B所示，提前給予Compound C(AMPK抑制劑)能消除3 μmol·L-1Rut上調SIRT1的作用(P<0.01)。結果進一步證實(Fig 4C和D)，與對照組相比，Ang Ⅱ可明顯減少p-AMPK水平(P<0.01)，Rut劑量依賴性地恢復p-AMPK的水平，提前加入CAPZ可部分消除Rut的這一作用(P<0.01)。

Fig 2 Effects of Rut on migration of VSMCs induced by Ang n=6)**P<0.01 vs control group;##P<0.01 vs Ang Ⅱ group;++P<0.01 vs Ang Ⅱ+Rut(3 μmol·L-1)group.

Fig 3 Rut regulated expression of SIRT1,p53 and p21 in VSMCs treated by Ang Ⅱ via activation of **P<0.01 vs control group;#P<0.05,##P<0.01 vs Ang Ⅱ group;+P<0.05,++P<0.01 vs Ang Ⅱ+Rut (3 μmol·L-1)group.

Fig 4 Involvement of TRPV1/AMPK pathway in regulation effects of Rut on SIRT1 n=6)**P<0.01 vs control group;#P<0.05,##P<0.01 vs Ang Ⅱ group;++P<0.01 vs Ang Ⅱ +Rut (3 μmol·L-1)group.

3 討論

我國傳統中藥吳茱萸在臨床用于治療心血管疾病已有近百年歷史，其主要成分Rut不僅能舒張血管產生降壓效應[10]，還可抑制VSMC增殖和表型轉換，從而抑制血管重構。近年來VSMC衰老在高血壓等疾病相關的血管老化中的作用日益收到重視，本研究進一步在Ang Ⅱ誘導的VSMC衰老模型觀察Rut的保護作用。SA-β-Gal染色是檢測細胞衰老的有效方法，衰老的細胞胞質內會生成大量藍色物質。結果顯示，加入1 μmol·L-1Ang Ⅱ到VSMC72 d可顯著增加藍染的衰老細胞數量，而預先給予吳茱萸次堿則可明顯減少衰老細胞。細胞衰老往往伴隨氧化應激反應增強，而產生過多的ROS又可進一步促進細胞發生衰老。本研究采用DCFH-DA熒光探針法檢測ROS水平發現，Rut在抑制Ang Ⅱ引起的VSMC 衰老同時還明顯抑制ROS生成。Rut的這一抗氧化效應在心肌細胞和單核細胞也有報道[11-12]。隨年齡增長，VSMC的遷移能力也隨之增強，從中膜遷移至內膜而導致血管壁重構，而Ang Ⅱ是促進這種衰老相關VSMC遷移的重要因素。本研究通過劃痕愈合和Transwell實驗進一步證實Rut還可明顯抑制Ang Ⅱ引起的VSMC遷移。這些結果表明，Rut可顯著抑制Ang Ⅱ引起的VSMC衰老和相關功能改變。

大量證據表明，SIRT1參與調節VSMC功能，被認為是藥物抑制VSMC衰老的重要靶點。在Ang Ⅱ引起的高血壓小鼠發現，SIRT1水平降低，而VSMC高表達SIRT1可降低血壓，減輕由Ang Ⅱ引起的血管重構，抑制ROS生成和血管炎癥。二甲雙胍、白藜蘆醇等SIRT1激活劑則可抑制Ang Ⅱ、高糖和動脈粥樣硬化等因素誘導的VSMC衰老和功能紊亂[13]。文獻報道SIRT1的抗衰老機制與抑制p53/p21有關[1]。SIRT1使p53乙酰化從而抑制其轉錄活性。p53是一種重要的衰老調節因子，能激活其下游基因p21，促進細胞衰老。p21是細胞周期依賴性激酶的廣譜阻滯劑，能抑制細胞周期依賴性激酶(CDKs)，阻止細胞從G1期進入S期和G2/M期。它被認為是細胞衰老的標志。此外，有證據表明SIRT1水平改變還可影響VSMC的遷移。Ox-LDL引起的VSMC源性的泡沫細胞遷移，與SIRT1水平降低有關，過表達SIRT1則可顯著抑制VSMC的遷移和侵入[14]，而白藜蘆醇和辣椒素等藥物可通過上調SIRT1水平可抑制VSMC遷移[15]。本研究結果表明，Ang Ⅱ可抑制SIRT1的表達，升高p53和p21的表達，不同劑量的Rut可劑量依賴性地恢復SIRT1的表達，同時抑制其下游p53和p21的表達上調。這些結果提示，Rut抗VSMC衰老和遷移作用與上調長壽蛋白SIRT1表達有關。

許多證據表明，Rut是TRPV1的激動劑[16]，Rut的降壓和抑制血管重構效應均與激活TRPV1有關[10]。本研究發現，預先給予TRPV1選擇性抑制劑CAPZ可取消Rut上調SIRT1表達及抑制Ang Ⅱ誘導的VSMC衰老效應，表明TRPV1介導了Rut上調SIRT1的抗衰老作用。在Ox-LDL引起的VSMC源性泡沫細胞和前脂肪細胞中，TRPV1激動劑辣椒素能上調SIRT1的表達[14]，提示TRPV1可能是調節SIRT1的重要靶點，但具體機制尚未闡明。腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)是維持細胞能量平衡的關鍵分子，是SIRT1的上游分子而調節其活性。運動、能量限制、及AMPK激活劑白藜蘆醇等可均通過激活AMPK升高SIRT1的表達[17]。有研究報道，TRPV1引起的一些作用與AMPK途徑有關[18]，如TRPV1的激動劑辣椒素引發的VSMC自噬和脂肪細胞的褐化效應，與促進p-AMPK相關[9]。激活TRPV1后可促進細胞內鈣生成，細胞內鈣通過CaMKII途徑激活AMPK。本研究發現，AMPK抑制劑Compound C可消除Rut上調SIRT1表達的作用。進一步檢測AMPK的磷酸化水平發現，Ang Ⅱ可抑制p-AMPK，提前加入Rut能恢復p-AMPK水平，這一作用可被CAPZ部分取消。結果提示，Rut通過激活TRPV1促進p-AMPK，從而上調SIRT1表達。

綜上所述，吳茱萸次堿可使SIRT1表達上調，抑制Ang Ⅱ誘導的VSMCs衰老和遷移，其機制涉及激活TRPV1/AMPK信號途徑。