結合網絡藥理學從JAK2/STAT3信號通路探討麻杏甘石湯抗流感病毒的效應機制

陳純靜，趙 澄，張香港，王 平，肖 榮，胡 玨，盧芳國,2

(1.湖南中醫藥大學醫學院，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南 長沙 410000)

流行性感冒的病原體是流感病毒，據世界衛生組織最新發布的報道，每年全球有約10億例流感病例，其中300萬～500萬為重癥病例，導致29萬至65萬患者死亡[1]。流感病毒屬正黏病毒科,病毒基因組為節段性負單鏈RNA，根據其抗原性和基因序列的不同，分為甲(A)、乙(B)、丙(C)、丁(D)四型。其中，甲型流感病毒(influenza A virus，IAV)是引起人及動物流感的主要病原體[2]，多次引起世界范圍內的大流行，嚴重威脅人類健康。研究表明，在流感病毒感染過程中，JAK/STAT信號通路被激活，在病毒介導的免疫病理反應中發揮著重要作用[3]。

中醫藥預防和治療流感在臨床中發揮著重要的作用。源自《傷寒論》的麻杏甘石湯，由麻黃、杏仁、甘草、石膏配伍而成，具有辛涼宣泄，清肺平喘之功效。我們的前期研究表明，麻杏甘石湯可抑制病毒增殖，并調節細胞因子的分泌，從而發揮抗流感病毒感染作用[4]。本研究以流感病毒肺部感染模型小鼠為研究對象，結合網絡藥理學探討JAK2/STAT3信號通路在流感病毒誘導的小鼠肺部炎癥中發揮的作用，以及麻杏甘石湯對該通路的調控機制。

1 材料

1.1 動物BLAB/c小鼠100只，SPF級，雌雄各半，體質量(20±2)g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物生產許可證號：SCXK(湘)2019-0004，實驗單位使用許可證編號：SYXK(湘)2019-0009。本實驗已通過湖南中醫藥大學動物實驗中心動物倫理委員會同意。

1.2 病毒株A型流感病毒小鼠肺適應株(A型，IAV，A/PR/8/34),由湖南師范大學病毒研究室惠贈。

1.3 藥物麻杏甘石湯組方藥材(麻黃、杏仁、石膏、甘草)購自湖南中醫藥大學第一附屬醫院中藥房。磷酸奧司他韋膠囊(規格：75 mg，以奧司他韋計×10粒，批號M1057，意大利Delpharm Milano S.r.l.生產，上海羅氏制藥有限公司分裝)購自中南大學湘雅三醫院門診藥房，用蒸餾水配制成質量濃度為2.165 g·L-1的混懸液；抗病毒顆粒(規格：9 g×10袋，批號：2001089，四川光大制藥有限公司)購自湖南中醫藥大學附屬第一醫院門診藥房，用蒸餾水配制成質量濃度為0.39 kg·L-1的溶液。

1.4 試劑兔抗鼠JAK2抗體(Abcam，ab39636)、STAT3抗體(Abcam，ab109085)；β-actin抗體(Proteintech，0070175)；RNA simple總RNA提取試劑盒(TIANGEN，DP419)、NovoScript cDNA合成試劑盒(Novoprotein，E047-01B)、NovoStartSYBR qPCR Super Mixture(Novoprotein，E096-01A)；PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成；小鼠IL-1β、IL-4 ELISA試劑盒(Elabscience，E-EL-M0037c，E-EL-M0043c)。

1.5 儀器組織光學掃描顯微鏡(Axioscope 5)+Axiocam 503 color顯微鏡攝像頭(蔡司科技(蘇州)公司)；ELX-800多功能酶標儀(美國Bio-Tek公司)；LightCycler96熒光定量PCR儀(瑞士羅氏公司)。

2 方法

2.1 麻杏甘石湯治療流感病毒感染的潛在靶點的篩選設置口服生物利用度(OB)≥30%、類藥性(DL)≥0.18，利用中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)檢索麻黃、苦杏仁、甘草的主要活性化合物，并查詢篩選主要活性化合物的作用靶點，該數據庫未檢索到的礦物藥“石膏”采用文獻研究方法查閱其主要活性化合物及靶點[5]；以“Influenza A virus”為關鍵詞，分別通過GeneCards(https://genecards.weiz-mann.ac.il/v3/)；OMIM(https://omim.org/)；PharmGkb(https://www.pharmgkb.org/)；TTD(http://db.idrblab.net/ttd/)；DrugBank(https://www.drugbank.ca/)數據庫篩選獲得IAV作用于人體的相關靶點；通過R4.0.3軟件將各數據庫獲取的靶點進行合并并去除重復靶點。運用R4.0.3軟件對麻杏甘石湯主要活性成分調控的靶點與流感病毒的疾病靶點取交集。

2.2 KEGG通路富集分析利用R4.0.3軟件對交集靶點進行KEGG通路富集分析。

2.3 制備麻杏甘石湯水煎液根據《方劑學》和《中藥藥理學》中麻杏甘石湯的藥物組成、劑量、制備方法制備該方水煎液，按其組成比例精確稱量麻杏甘石湯1劑的藥材量，加入10倍體積蒸餾水后煮沸，改小火后再煎煮30 min，煎煮完畢后濾過；二煎加入7倍體積蒸餾水，煮沸后再煎煮2 0 min，煎煮完畢后濾過，合并2次濾液，水浴濃縮至含生藥605 g·L-1。

2.4 分組與給藥100只BLAB/c小鼠適應性喂養2 d后，隨機將小鼠分為正常對照組、模型對照組、奧司他韋組(西藥對照組)、抗病毒顆粒組(中藥對照組)和麻杏甘石湯組，每組20只小鼠。除正常對照組外，其余組建立A型流感病毒肺部感染模型。感染24 h后，各藥物組按臨床等效劑量灌胃給藥，每天1次，每次0.2 mL，連續給藥3、7 d。奧司他韋、抗病毒顆粒、麻杏甘石湯組的給藥劑量分別為0.0216、3.9、6.05 g·kg-1·d-1。對照組和模型組均給予等量生理鹽水。

2.5 標本采集分別于給藥治療d 3、7，將小鼠禁水禁食8 h后，每組隨機選取10只小鼠，稱動物體質量后，摘眼球放血法處死小鼠，轉移至超凈工作臺內進行解剖，取出小鼠肺臟，用生理鹽水沖洗臟器表面血跡，用濾紙吸干后稱取小鼠肺臟質量，取部分肺組織置于4%多聚甲醛中固定，部分肺組織置于1.5 mL EP管中，凍存于-80 ℃超低溫冰箱備用。

2.6 指標檢測

2.6.1體質量及肺指數 肺指數(mg·g-1)=肺臟質量(mg)/體質量(g)

2.6.2肺組織病理變化情況 取出固定于4%多聚甲醛中24 h的肺組織，經石蠟包埋、切片(5 μm)、二甲苯脫蠟、梯度酒精脫水后進行HE染色，在光學顯微鏡下(×100)觀察肺組織病理變化。

2.6.3RT-PCR法檢測肺組織中JAK2、STAT3、IL-1β、IL-4mRNA的表達水平 取出-80 ℃保存的肺組織，按照總RNA提取試劑盒說明書提取各組樣品的總RNA，去DNA后逆轉錄合成cDNA。以cDNA做模板，按NovoStartSYBR qPCR Super Mixture試劑說明，分別加入β-actin、JAK2、STAT3、IL-1β、IL-4引物進行擴增，引物序列見Tab 1。PCR反應體系為20 μL，反應體系含cDNA 2 μL，NovoStartSYBR qPCR Super Mixture 10 μL，10 μmol·L-1上下游引物各2 μL，以dd H2O補足至20 μL。反應條件：95 ℃ 1 min；95 ℃ 20 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，40個循環；95 ℃ 10 s，65 ℃ 60 s，97 ℃ 1 s繪制熔解曲線。采用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量。

Tab 1 Primer sequences for RT-PCR

2.6.4Western blot法檢測肺組織中JAK2、STAT3蛋白的表達水平 取出-80 ℃保存的肺組織，加入適量細胞裂解液與蛋白酶抑制劑，使用組織研磨器進行組織勻漿，冰上靜止30 min后離心，提取上清液中組織總蛋白質，應用BCA法測定蛋白濃度，取40 μg總蛋白上樣，進行SDS-PAGE電泳，轉膜后，封閉處理1 h，分別加入JAK2一抗(1 ∶1 000)、STAT3一抗(1 ∶2 000)、β-actin(1 ∶10 000)，4 ℃孵育過夜，二抗(1 ∶5 000)室溫孵育1 h，避光顯影。

2.6.5ELISA法檢測肺組織IL-1β、IL-4分泌水平 取出-80 ℃保存的肺組織，加入一定量PBS及蛋白酶抑制劑，使用組織研磨器進行組織勻漿，離心后取上清液，分裝保存，按照ELISA試劑盒說明書進行操作，檢測肺組織中IL-1β、IL-4分泌水平。

2.7 分子對接查詢STAT3所對應的麻杏甘石湯活性化合物為甘草查爾酮A(licochalcone a)，從PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)數據庫下載其sdf格式化合物，用ChemBio3DUltra 14.0.0.117軟件進行3D結構轉換。從PDB數據庫(http://www.rcsb.org)下載STAT3的晶體結構，利用PyMOL2.4軟件刪除水分子，添加氫等預處理，利用AutoDock Tools1.5.6可視化軟件確定STAT3的活性口袋，利用AutoDock Vina1.1.2軟件進行分子對接。

2.8 統計學分析采用SPSS 24.0統計軟件進行數據分析，多組樣本間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，方差齊時，用LSD進行多重比較，方差不齊采用Kruskal-Wallis秩和檢驗。

3 結果

3.1 麻杏甘石湯治療流感病毒感染的潛在靶點篩選按照OB≥30%、DL≥0.18的條件，通過TCMSP數據庫及文獻查閱篩選麻杏甘石湯主要活性化合物，并查詢主要活性化合物調控的靶點信息，共篩選出對應的作用靶點共2 124個，去除重復后共234個。分別在GeneCards、OMIM、DrugBank、PharkGkb、TTD數據庫中檢索流感病毒作用于人體的潛在靶點，去掉重復得到2 089個流感病毒相關靶點。運用R4.0.3軟件將麻杏甘石湯主要活性成分調控的靶點與流感病毒的疾病靶點取交集，得到110個共同靶點，即麻杏甘石湯治療流感病毒感染的潛在靶點，見Fig 1。

Fig 1 Venn plot of intersection target of Maxing Ganshi Decoction and influenza virus

3.2 潛在靶點KEGG通路富集分析通過R語言對110個潛在靶點進行KEGG分析，發現交集靶點共富集于170條信號通路，主要與病毒或病原微生物感染、各細胞因子介導的信號轉導通路有著密切聯系。根據P值大小進行排名，前三位分別是AGE-RAGE、Hepatitis B、Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection信號通路。根據富集的靶點數目排名，最多的為Hepatitis B、Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection、Human cytomegalovirus infection 3條信號通路，均富集31個靶點。本研究展示了富集靶點數目排名前三的信號通路，見Tab 2。結合本課題組前期基礎，本研究主要探討JAK/STAT信號通路在流感病毒感染過程中發揮的作用以及麻杏甘石湯調控作用。根據P值大小，JAK/STAT信號通路在170條信號通路中排名84位，P=0.000 000 470 7，富集13個靶點，見Fig 2。

Fig 2 Potential targets of MXGSD on JAK/STAT signaling pathway

Fig 3 Pathological observation of lung tissues of mice in each group after 3 (upper)and 7 (lower)days of administration (HE,100 ×)

3.3 體質量及肺指數由Tab 3得知：給藥治療3、7 d后，模型對照組小鼠體質量較正常對照組降低(P<0.05或0.01)；給藥治療3 d后，奧司他韋組、抗病毒顆粒組、麻杏甘石湯組體質量較模型對照組升高(P<0.05或0.01)；給藥治療7 d后，奧司他韋組體重較模型對照組升高(P<0.05)，抗病毒顆粒組、麻杏甘石湯組體重較模型組有升高趨勢，但差異無統計學意義。由Tab 4得知：給藥治療3、7 d后，模型對照組小鼠肺指數較正常對照組升高(P<0.01)；給藥治療3 d后，奧司他韋組、抗病毒顆粒組、麻杏甘石湯組肺指數較模型對照組降低(P<0.05或0.01)；給藥治療7 d后，奧司他韋組、麻杏甘石湯組肺指數較模型對照組降低(P<0.05)，抗病毒組肺指數較模型對照組有降低趨勢，但差異無統計學意義。

Tab 2 Top three signaling pathways in number of KEGG targets

Tab 3 Comparison of body weight and weight inhibition rate in each group n=10)

Tab 4 Comparison of lung index and inhibition rate in each group of mice n=10)

3.4 肺組織病理變化由Fig 3得知，與正常對照組比較，模型對照組小鼠肺組織出現明顯病理變化，表現為肺泡充血水腫，大量炎性細胞浸潤，并出現實變及壞死。與模型對照組比較，各藥物組小鼠肺部病理損傷明顯改善，肺泡輪廓恢復正常，充血水腫減輕，炎性細胞浸潤減少。

3.5 肺組織中JAK2、STAT3、IL-1β、IL-4 mRNA的表達水平由Tab 5得知，給藥治療3、7 d后，與正常對照組相比，模型對照組JAK2、STAT3、IL-1β表達量增加(P<0.01)，IL-4基因相對表達量降低(P<0.01)；與模型對照組相比，給藥治療3 d后，各藥物組JAK2、IL-1β表達量降低(P<0.01)，IL-4表達量增加(P<0.01)，抗病毒顆粒組和麻杏甘石湯組STAT3表達量降低(P<0.01)；給藥治療7 d后，抗病毒顆粒組和麻杏甘石湯組JAK2表達量降低(P<0.01)，各藥物組STAT3、IL-1β表達量降低(P<0.01)，IL-4表達量增加(P<0.01)。

3.6 肺組織中JAK2、STAT3蛋白的表達水平由Fig 4、5得知，給藥治療3、7 d后，與正常對照組相比，模型對照組JAK2、STAT3蛋白表達量增加(P<0.01或P<0.05)；與模型對照組相比，各藥物組JAK2蛋白表達量降低(P<0.01)。給藥治療3 d后，與模型對照組相比，各藥物組STAT3蛋白表達量降低(P<0.01)。給藥治療7 d后，與模型對照組相比，奧司他韋組STAT3蛋白表達量降低(P<0.05)，其余兩藥物組STAT3蛋白表達水平無明顯差異。

Fig 4 Expression level of JAK2 protein in lung tissues of mice in each group n=3)A.Control；B.Model;C.Oseltamivir;D.Antiviral particle;E.MXGSD.**P<0.01 vs control group;##P<0.01 vs model group.

Fig 5 Expression level of STAT3 protein in lung tissues of mice in each group n=3)A.Control;B.Model;C.Oseltamivir;D.Antiviral particle;E.MXGSD.**P<0.01 vs control group;#P<0.05,##P<0.01 vs model group.

3.7 肺組織IL-1β、IL-4分泌水平由Tab 6得知，給藥治療3、7 d后，與正常對照組相比，模型對照組肺組織勻漿中IL-1β表達量增加(P<0.01)，IL-4表達量降低(P<0.01)。與模型對照組相比，給藥治療3 d后，抗病毒顆粒組和麻杏甘石湯組肺組織勻漿中IL-1β表達量降低(P<0.01)，給藥治療7 d后，奧司他韋組與抗病毒顆粒組肺組織勻漿中IL-1β表達量降低(P<0.01)，麻杏甘石湯組也較模型對照組降低，但差異無統計學意義。與模型對照組相比，給藥治療3 d后，奧司他韋組和麻杏甘石湯組肺組織勻漿中IL-4表達量增加(P<0.01)，給藥治療7 d后，各藥物組肺組織勻漿中IL-4表達量均增加(P<0.01)。

Tab 5 Relative expression of JAK2,STAT3,IL-1 β and IL-4 genes in lung tissues of mice in each group (2-△△Ct) n=3)

Tab 6 Levels of IL-1β and IL-4 in lung tissues of mice in each group n=3)

3.8 STAT3與麻杏甘石湯活性成分分子對接結果根據文獻報道[6]，化合物和靶標之間的結合自由能<-5 kcal·mol-1被認為具有較好的結合作用。本研究查詢STAT3所對應的麻杏甘石湯小分子配體為甘草查爾酮A(licochalcone A)，通過PubChem數據庫及ChemBio3D Ultra軟件得到甘草查爾酮A的3D結構。從PDB數據庫下載STAT3的晶體結構，PDB ID為：6njs。利用AutoDock Tools1.5.6可視化軟件確定STAT3的活性口袋，活性口袋網格中心的坐標為：x=-2.257，y=19.47，z=24.491。借助AutoDock Vina1.1.2軟件，對STAT3與甘草查耳酮A(licochalcone A)進行分子對接，結果顯示，兩者的結合能為-6.3 kca·mol-1，表明STAT3與藥物有較好的結合活性，見Fig 6。本研究還對西藥陽性對照藥物奧司他韋與STAT3進行了分子對接，結果顯示，兩者之間的最小結合自由能為-3.9 kcal·mol-1，意味著兩者無很好的結合活性。

Fig 6 Schematic diagram of molecular dockingbetween STAT3 and licochalcone A

4 討論

眾所周知，病毒感染初期，機體固有免疫系統被激活，肺部炎癥細胞募集，產生炎性細胞因子和趨化因子參與機體免疫應答，發揮抗病毒作用。但在流感病毒持續感染或重癥感染的過程中，免疫系統持續激活，導致免疫應答反應過度，免疫穩態失衡，進而釋放大量炎癥因子，誘導細胞因子的級聯放大效應，形成“細胞因子風暴”，出現肺部免疫病理損傷，引起彌漫性肺泡損傷、透明膜形成、纖維蛋白滲出等。“細胞因子風暴”導致的急性肺損傷被認為是流感病毒感染致死的主要原因[7]。目前，關于流感病毒感染后發生“細胞因子風暴”的機制尚未完全闡明，有研究發現，甲型流感病毒感染后，宿主細胞內STAT、NF-κB等多條信號通路激活，導致IL-1β、IL-6、IL-18等炎癥因子的過度表達，且炎癥因子的水平與疾病的嚴重程度呈正相關，提示相關信號通路的激活及下游效應分子的分泌可能在流感“細胞因子風暴”的發生中起到一定作用[8]。JAK/STAT信號轉導通路是多種細胞因子發揮作用的重要信號通路之一，參與許多重要生理反應過程，與“細胞因子風暴”的發生密切相關[9]。JAK2作為Janus激酶家族成員之一，廣泛存在于各種組織和細胞中，其下游效應分子為STAT3，STAT3被JAK2磷酸化后發生二聚化，然后穿過核膜進入核內調節相關基因的表達。JAK2/STAT3信號通路在免疫調節和多種炎癥過程中發揮著重要的作用。有研究發現，JAK2過表達可促進H5N1流感病毒的復制，而特異性抑制JAK2表達后，病毒復制減輕，JAK2可能成為抗流感病毒治療的潛在靶點[10]。

在流感病毒感染的小鼠肺組織中，JAK2、STAT3基因表達水平及蛋白表達量較正常小鼠均增加，說明機體JAK2/STAT3信號通路被激活，在流感病毒導致的肺部炎癥中發揮著一定的作用。在數據庫中篩選流感病毒的靶點時，物種為“Homo”即人類，我們進行動物驗證實驗的對象為小鼠，通過NCBI對人和小鼠的JAK2、STAT3蛋白序列進行查找及blast比對，其一致性分別為93.58%、99.48%(E value=0.0)。同時，本課題組還檢測了IL-1β、IL-4兩種炎癥因子，發現與正常對照組相比，模型對照組肺組織勻漿中IL-1β表達量增加，而IL-4表達量降低。IL-1β是感染過程中的關鍵細胞因子，具有廣泛的促炎活性，能夠活化多種炎癥細胞,介導炎癥介質、趨化因子的釋放[11]。IL-4可抑制TNF-α和IL-6等炎癥因子的表達，是一種重要的免疫調節細胞因子。本研究結果提示，JAK2/STAT3信號通路在流感病毒誘導小鼠肺部炎癥的發病機制中有著重要的作用，其機制可能是該信號通路激活后下游細胞因子的表達水平發生變化，免疫穩態失衡，促炎因子增多，進而引起炎癥反應。在早期干預該信號通路的激活，可以有效減輕肺部免疫病理損傷。

中藥在流感防治中發揮著重要的作用。麻杏甘石湯組方精當，療效顯著，為歷代醫家所重視。現代研究表明，麻杏甘石湯具有較好的解熱、抗炎、抗病毒等作用，對甲型H1N1流感有很好的療效[12]。國家衛生健康委員會發布的2018-2020版《流行性感冒診療方案》中，均將該方作為中醫熱毒襲肺證的基礎治療方[13]。有研究表明，麻杏甘石湯可減輕哮喘大鼠氣道炎癥反應，其機制可能與STAT4及IL-13/STAT6/黏蛋白途徑有關[14]。本研究發現，臨床等效劑量麻杏甘石湯能夠下調流感病毒感染的小鼠肺組織中JAK2、STAT3基因表達和蛋白表達水平，降低肺組織中IL-1β分泌水平，增加IL-4分泌水平，改善肺部炎癥。提示該方可通過抑制流感病毒誘導的JAK2/STAT3信號通路的激活，調節炎癥因子表達，以抵抗流感病毒感染導致的急性肺損傷。我們查詢了核心靶點STAT3所對應的麻杏甘石湯活性化合物，結果顯示，麻杏甘石湯中與STAT3具有結合作用的活性化合物為甘草查爾酮A。分子對接結果表明，二者之間的結合能為-6.3 kcal·mol-1，具有較好的結合活性。甘草查爾酮A來源于甘草，屬于麻杏甘石湯方中佐使藥，既能益氣和中，又能防止石膏寒涼傷中，調和于寒溫宣降之間。研究發現，甘草查爾酮A具有明顯的抗炎活性，可通過調節相關信號通路來抑制骨關節炎和類風濕性關節炎的發生發展[15]，我們的研究為闡明甘草查爾酮A的抗炎機制及豐富其臨床應用提供了一定的啟發。同時，我們對西藥陽性對照藥物奧司他韋與STAT3進行了分子對接，兩者之間的最小結合自由能為-3.9 kcal·mol-1，無很好的結合活性。奧司他韋屬于神經氨酸酶抑制劑，可通過抑制流感病毒的復制及播散，發揮抗流感效應。我們的實驗結果表明，麻杏甘石湯可通過調節宿主相關信號通路，緩解流感病毒引起的炎癥因子失衡。這也是對中醫藥“整體觀”的一種體現，整體觀講究免疫平衡，流感的發生不僅是“外邪”的入侵，也與機體本身的免疫狀態密切相關，麻杏甘石湯通過調節機體的免疫平衡，維護免疫穩態，在此過程中，甘草查爾酮A作為其有效的物質基礎，通過結合STAT3，發揮抗炎作用。同時我們還發現，麻杏甘石湯對JAK2也具有一定的調節作用，這與網絡藥理學的結果并不完全一致。

綜上所述，本研究初步奠定了JAK2/STAT3信號通路在流感病毒感染導致的肺部炎癥中的地位，并證實麻杏甘石湯通過抑制該信號通路的激活，減輕肺部炎癥，為中醫藥防治流感提供了一定的數據支持。但本研究尚存在諸多不足，例如在藥物劑量方面，我們目前選取的是臨床等效劑量，實驗結果表明，該劑量的麻杏甘石湯對JAK2/STAT3信號通路具有一定的作用，但這種作用是否具有量-效關系還有待進一步的研究，量-效關系的研究將有助于指導臨床給藥劑量的優化。此外，在進行相關指標基因及蛋白表達水平的檢測時，選取的樣本數目較少，后期在進行量-效關系的驗證時，我們將會進一步加大樣本量，以增強實驗結果的可信度。