酸棗仁凍干粉對大鼠睡眠覺醒狀態及能量代謝率的干預作用研究

徐文祥，阮養春，卞宏生，王艷艷，于 爽，李廷利，黃莉莉

(黑龍江中醫藥大學藥學院，黑龍江 哈爾濱 150040)

睡眠是人體重要的生理活動，也是人體恢復精力所必需的條件。近年來，隨著互聯網的普及，電子產品的使用占據了人們大量的睡眠時間，年輕人睡眠不足的情況越發嚴重。睡眠不足可引起機體反應下降，記憶力減退。長時間睡眠不足會導致高血壓、糖尿病、冠心病等疾病，甚至可以增加死亡率[1]。睡眠不足引起的能量代謝紊亂是誘導肥胖產生的重要因素。2004年，哥倫比亞大學開展了一項睡眠時間調查研究，該研究項目隨機抽取18 000名受試者，受試者年齡均在32～59歲之間。經過研究發現，與每天睡7 h的人相比，睡6 h的人肥胖的幾率要高23%，睡5 h的人肥胖的幾率要高50%，睡眠時間少于4 h的人肥胖的幾率要高73%[2]。由此可見，睡眠不足引起的肥胖正受到廣泛的關注，更多的學者投入其中，旨在闡明睡眠不足與能量代謝的交互影響及相關機制。

掩蔽(masking)是光照中最普遍的參數。正性掩蔽為白天活動的物種在白天接受光照時，其活動性增強。夜間活動的物種在夜間接受黑暗時其活動性增強，該結論已被廣泛認可[3-4]。實驗室前期研究發現：24 h持續黑暗可以很好的影響大鼠的睡眠-覺醒節律，對于探討大鼠的睡眠-覺醒狀態及能量代謝率的變化提供了一個方便可靠的造模方法。

酸棗仁系鼠李科植被酸棗的干燥成熟種子，性平，味酸甘，廣泛分布于我國東北、西北、華北及南方等地。酸棗果肉中含有豐富的維生素 C 及多種人體所需氨基酸[5]，為國家衛生部頒布的首批藥食兩用品。研究表明，酸棗仁具有抗焦慮、鎮靜催眠、抗抑郁、抗驚厥等作用[6]。長期的臨床應用與大量的實驗研究均證明，酸棗仁具有改善睡眠的功效[7]。但是，迄今為止，關于酸棗仁對睡眠-覺醒狀態中大鼠的睡眠覺醒狀態變化及能量代謝率的相關研究未見報道，相關機制并不明確。

針對以上問題，本實驗采用皮層腦電描記聯合實驗動物監測系統，觀察酸棗仁對持續黑暗條件下，大鼠睡眠覺醒狀態及能量代謝率的影響。同時，利用酶聯免疫試劑盒，檢測在酸棗仁的干預作用下，參與下丘腦內能量調控的瘦素(lepin，LEP)、阿黑皮素原(proopiomelanocortin，POMC)、阿神經肽Y(neuropeptide Y，NPY)的含量變化。以此闡明酸棗仁對睡眠覺醒狀態紊亂及能量代謝異常的調控作用，為酸棗仁的應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 動物SPF級SD雄性大鼠36只，體質量220～260 g，實驗動物許可證號：SCXK(黑)2013-004，由黑龍江中醫藥大學實驗動物中心提供。常規飼養于SPF級動物飼養室中，室溫22～26 ℃，濕度40～70%，12 h明暗交替光照。動物可自由獲取水和食物。

1.2 藥品及試劑炒酸棗仁凍干粉(經HPLC測定炒酸棗仁總黃酮含量為0.913 8%，總皂苷含量為3.503%。取炒酸棗仁粗粉230 g(由生酸棗仁置炒鍋內在130 ℃炒制4 min制得)，加入8倍量的蒸餾水煎煮，過濾藥液并用旋轉蒸發儀濃縮至含生藥量2 kg·L-1，濃縮液進行冷凍干燥得23 g凍干粉末(生藥量10 g·g-1)。由山西大學秦雪梅教授鑒定并提供，由黑龍江中醫藥大學中藥藥理教研室制備。)。水合氯醛(天津市巴斯夫化工有限公司，批號：津Q/HG 3-371-2001)；義齒基托樹脂(上海新世紀齒科材料有限公司，批號：20141105)；義齒基托聚合物(哈爾濱市齒科器材廠有限公司，批號：130829)；LEP酶聯免疫試劑盒、POMC酶聯免疫試劑盒、NPY酶聯免疫試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號：04/2017)。

1.3 儀器與設備實驗動物監測系統：型號CLAMS，美國COLUMBUS公司(系統是由活動評價模組及睡眠探測分析模組構成，組成系統的睡眠高通量篩選功能)，大鼠腦立體定位儀(51600型，美國Stoelting公司)，十六通道生理記錄儀(MP150，美國Biopac公司，SleepSign動物睡眠分析軟件)，多功能微孔板檢測儀(SynergyMx，美國BioTek公司)，分析天平(MS204S，美國Mettler Toledo公司)，低溫高速離心機[3-18R(3006004)，美國TOMOS公司]。

1.4 動物分組及模型復制將SD大鼠在實驗室飼養環境條件下飼養7 d，適應環境，自由飲食飲水。7 d后，將實驗動物隨機分為兩組，睡眠-覺醒狀態能量代謝組、機制研究組，每組18只。第一組進行腦皮層電極埋置手術，實驗前將SD大鼠禁食24 h，正常飲水。SD大鼠腹腔注射10%水合氯醛進行麻醉，麻醉后置于大鼠腦立體定位儀上，夾住雙耳固定，剃除大鼠腦部毛發并剪開皮膚，暴露出顱骨，用酸蝕劑酸蝕顱骨骨膜，露出白色顱骨，期間用生理鹽水不斷沖洗血漬，并用棉球進行相應止血，擦干血漬后可見清晰的顱骨縫隙紋路，在人字縫前1 mm及冠狀縫前1 mm與顱骨中線右側旁開1 mm交點處鉆孔，露出硬腦膜，埋置腦電電極(electroencephalogram，EEG)，顱骨中點左側旁開2 mm鉆孔，露出硬腦膜，埋置固定螺絲。在頸部肌肉下埋置肌電電極(electroyography，EMG)，將EEG，EMG電極導線連接于微型插座，纏繞導線，涂抹義齒基托聚合物和義齒基托樹脂使微型插座固定于大鼠腦部，待義齒基托樹脂風干固定后將大鼠隨機分為12 h明暗交替組(L/D:12 h/12 h，LD)、持續黑暗組(DD：24 h，DD)和給藥組(medication administration Team，MAT)，每組6只。置于相應條件的能量代謝籠中，恢復7 d。恢復后于8 d早7:00進行EEG，EMG的描記，連續描記24 h。

機制研究組大鼠隨機分為LD組、DD組和MAT組(24 h持續黑暗)，每組6只。置于相應條件的能量代謝籠中，單籠飼養7 d，適應環境。于8 d早7：00進行給藥處理。

1.5 給藥方法取制得的酸棗仁凍干粉5.6 g定容至10 mL，每天按大鼠體質量10 mL·kg-1灌胃一次，劑量為56 g·kg-1·d-1(生藥量)。(經本實驗室前期預實驗研究表明，該給藥量及給藥天數可以有效拮抗焦慮)。睡眠-覺醒狀態能量代謝組中，MAT組每日早7:00灌胃給藥，連續給藥7 d，LD組與DD組給予相同體積的蒸餾水。機制研究組中MAT組每日早7:00灌胃給藥，連續給藥7 d，LD組與DD組給予相同體積的蒸餾水。

1.6 指標檢測

1.6.1大腦皮層腦電描記與分析聯合CLAMS系統判斷大鼠睡眠-覺醒狀態 睡眠-覺醒狀態能量代謝組大鼠大腦皮層腦電埋置手術結束后，在不同實驗條件下的能量代謝籠中恢復7 d，恢復后于8 d早7：00開始描記，連續描記24 h。應用SleepSign分析軟件，每30 s一幀采集數據，對大鼠睡眠-覺醒時間圖譜進行分析，記錄大鼠在不同光照條件下的睡眠時相及睡眠時間，同時依據CMAMS監測系統的睡眠檢測分析模組、活動評估模組、根據大鼠腦電圖及肌電圖將大鼠睡眠-覺醒周期分為三種時相，即覺醒(waken，W)、非快速動眼睡眠(non-rapid eye movement sleep，NREM)及快速動眼睡眠(rapid eye movement sleep，REM)。

1.6.2CLAMS系統監測大鼠能量代謝率 在大鼠進行腦電描記實驗時，同時利用CLAMS系統的睡眠檢測分析模組、活動評估模組、攝食檢測評估模組、間接測熱裝置對大鼠進行監測，監測時間為早7:00至次日早7:00，連續記錄24 h。監測大鼠的自主活動次數、攝食量、產熱量。系統設定每10 s采集一次數據，采集參數為：1 sample/10 s。

1.6.3酶聯免疫法檢測下丘腦中POMC、LEP、NPY含量變化 機制研究組灌胃給藥7 d后，于8 d早7:00進行麻醉處理，麻醉后將大鼠斷頭取腦，小心剝離出大鼠下丘腦部位，在經過分析天平精密稱定后，加入9倍量的生理鹽水，置于冰水浴中充分勻漿，設定離心轉速3 000 r·min-1，離心10 min后取上清液，置于冰箱冷藏室保存。取出冷藏的試劑盒，在室溫下放置30 min充分復溫平衡，根據試劑盒說明進行相關操作。應用微孔檢測儀在450 nm處測定其OD值，并依此計算出標準曲線的回歸方程，最終確定樣品中POMC、LEP、NPY含量。

2 結果

2.1 大腦皮層腦電描記與分析聯合CLAMS系統判斷睡眠覺醒狀態及能量代謝率的影響

2.1.1大腦皮層腦電描記大鼠睡眠-覺醒狀態(24 h)中W、NREM、REM百分比的變化 結果見Tab 1。與LD組比較，DD組白天W增多(P<0.01)，NREM減少(P<0.01)，REM減少(P<0.01)。夜晚W差異無顯著性，NREM減少(P<0.01)，REM差異無顯著性。與DD組比較，MAT組白天W減少(P<0.05)，NREM增多(P<0.05)，REM增多(P<0.05)。夜晚W差異無顯著性，NREM差異無顯著性，REM增多(P<0.05)。

Tab 1 Percentage change of W，NREM，REM under conditions of LD，DD，MAT in sleep-arousal cycle (24 h)in

2.1.2CLAMS系統監測大鼠睡眠-覺醒狀態(24 h)中睡眠和覺醒時間百分比的變化 結果見Fig 1。與LD組比較，DD組白天覺醒時間增多(P<0.01)，白天睡眠時間減少(P<0.01)，夜晚覺醒時間差異無顯著性，夜晚睡眠時間差異無顯著性。全天覺醒時間增多(P<0.01)，全天睡眠時間減少(P<0.01)。與DD組比較，MAT組白天覺醒時間減少(P<0.05)，白天睡眠時間增多(P<0.05)，夜晚覺醒時間差異無顯著性，夜晚睡眠時間差異無顯著性，全天總覺醒時間減少(P<0.05)，全天總睡眠時間增多(P<0.05)。

Fig 1 Percentage change in wakefulness and sleep duration under conditions of LD，DD，MAT in rats during wakefulness-sleep cycle (24 h)1:daytime waking time;2:daytime sleep time;3:night waking time;4:night sleep time;5:all day waking time;6:all day sleep time. ##P<0.01 vs LD Group;*P<0.05 vs DD Group

2.1.3大鼠睡眠-覺醒狀態(24 h)中能量代謝率的變化 結果見Fig 2-5。與LD組比較，DD組白天自主活動次數增多(P<0.01),白天攝食量差異無顯著性、白天產熱量差異無顯著性。夜晚自主活動次數差異無顯著性、夜晚攝食量增多(P<0.05)、夜晚產熱量減少(P<0.05)。全天自主活動次數增多(P<0.01)、全天總攝食量增多(P<0.05)、全天產熱量減少(P<0.05)，實驗動物體質量顯著增加(P<0.05)。與DD組比較，MAT組實驗動物白天自主活動次數減少(P<0.05)、攝食量差異無顯著性、產熱量增多(P<0.05)。夜晚自主活動次數差異無顯著性、攝食量減少(P<0.05)、產熱量增多(P<0.05)。全天總自主活動次數減少(P<0.05)、總攝食量減少(P<0.05)、產熱量增多(P<0.05)，動物體質量增加量減少(P<0.05)。

2.2 酸棗仁凍干粉對DD條件下大鼠下丘腦能量調節系統中的LEP、POMC、NPY影響結果見Fig 6。與LD組比較，DD組下丘腦內LEP含量降低(P<0.01)，POMC含量降低(P<0.01)，NPY含量升高(P<0.05)。與DD組比較，MAT組下丘腦內LEP含量升高(P<0.01)，POMC含量升高(P<0.01)，NPY降低(P<0.01)。

Fig 2 Changes of autonomic activity in wake-sleep ##P<0.01 vs LD Group;*P<0.05 vs DD Group

Fig 3 Changes of food intake in sleep-wake #P<0.05 vs LD Group;*P<0.05 vs DD Group

Fig 4 Changes of middle- calories during sleep-wake cycle (24 h)in #P<0.05 vs LD Group;**P<0.01，*P<0.05 vs DD Group

Fig 5 Changes of body weight gain during sleep-wake cycle (24 h)in #P<0.05 vs LD Group;*P<0.05 vs DD Group Fig 6 Effect of freeze-dried powder of jujube kernel on LEP， #P<0.05,##P<0.01 vs LD Group;**P<0.01 DD Group

3 討論

晝夜節律系統也叫做生物鐘系統，是自然界中生物日夜活動的基本規律。晝夜節律周期由生物的基因決定，每一個生物節律周期基本等于24 h，動物的睡眠、覺醒、狩獵、繁衍等活動都具有顯著的晝夜節律特征[8]。國內外相關調查及實驗研究均表明，缺乏睡眠導致的晝夜節律紊亂會使機體能量代謝出現異常，這也是誘導肥胖形成的重要因素[9]。

下丘腦是機體的能量代謝控制中心，下丘腦中含有多種抑食因子及增食因子，它們相互干預，互相調控使機體處于能量穩定狀態，瘦素及阿黑皮素原都是重要的抑食因子。瘦素主要與位于下丘腦弓狀核的瘦素受體結合，通過激活阿黑皮素原(POMC)，達到抑制神經肽 Y的作用[10]。瘦素由白色脂肪細胞分泌，是一種多肽類激素[11]。可以調控中樞神經系統對糖脂代謝、能量代謝的平衡。

阿黑皮素原是一類神經肽，經水解后形成多種肽，包括促黑激素、促腎上腺皮質激素、β-內啡肽等，在垂體、弓狀核、胰腺、皮膚、睪丸等均發現其表達[11-12]。瘦素可以影響阿黑皮素原在弓狀核的表達，當瘦素濃度低時，阿黑皮素原表達減少，升高瘦素濃度，阿黑皮素原表達隨之增加，在血液中兩者濃度成正比關系。實驗表明，在給大鼠注射瘦素時，阿黑皮素原表達增加，動物表現出攝食量的下降，表明瘦素部分依賴于阿黑皮素原的變化從而發揮其生物學作用[13]。

神經肽Y是一種由36 個氨基酸組成的生物活性多肽,其在下丘腦的濃度很高,主要分布于下丘腦弓狀核神經元。目前已知神經肽Y是最強的中樞食欲促進因子,可促進食欲、增加進食,促進攝入高糖、高脂的食物，神經肽Y的增加是肥胖產生的重要因素。神經肽Y是瘦素作用的介質,研究發現腦室內注射瘦素可以顯著降低神經肽Y mRNA的表達，表明瘦素與神經肽Y存在負向調節機制[14]。

現代藥理學表明，酸棗仁具有鎮靜催眠、抗焦慮、抗抑郁等作用。長期實驗研究和大量的臨床實踐均表明，酸棗仁具有改善睡眠的作用。但是，到目前為止，尚未見到有關酸棗仁對睡眠-覺醒狀態中能量代謝率影響的研究。

基于上述問題，本課題開展了酸棗仁對持續黑暗條件下睡眠-覺醒狀態及能量代謝率的影響和其變化機制的研究，并討論。

3.1 正常光照條件下大鼠在24 h周期中能量代謝率的改變本實驗采用SD雄性大鼠為研究對象，首先進行腦部電極及肌肉電極埋置手術，后置于LD條件中進行單籠飼養。同時利用腦電描記系統聯合CLAMS系統，對大鼠睡眠-覺醒時間，自主活動次數，攝食量，產熱量進行實時監測。結果表明與白天相比，夜晚大鼠的機體活性明顯增強，其表現在夜晚覺醒時間延長、活動次數、攝食量、產熱量均增加，該實驗結果與相關文獻報道一致[15]。由此可以看出，嚙齒類動物屬于夜型性動物，其晝夜節律與人類相反，夜晚的能量代謝率高于白天。

3.2 持續黑暗條件下大鼠在24 h周期中能量代謝率的變化將實驗大鼠置于24 h持續黑暗條件下，經過研究發現，與LD組大鼠相比，DD組大鼠覺醒時間、活動次數、攝食量、體質量均顯著增加，睡眠時間、產熱量則明顯下降。該結果表明24 h持續黑暗條件會對大鼠的晝夜節律產生影響，使大鼠睡眠時間減少，從而導致大鼠機體能量代謝的紊亂，誘導肥胖的產生。在當今社會中，隨著城市化的發展，人們正處于這種過度光照的環境下，尤其是年輕人每天長時間接受光照，甚至處于全天光照的環境中。該現象與實驗中24 h持續黑暗條件相類似，會使人體處于晝夜節律紊亂的狀態，從而導致人體能量代謝紊亂，誘導肥胖的產生[16-17]。

3.3 酸棗仁凍干粉對大鼠在24 h周期中能量代謝率干預作用的探究對處于持續黑暗條件下的大鼠給予酸棗仁凍干粉干預后，大鼠覺醒時間、活動次數、攝食量、體質量均顯著減少，睡眠時間、產熱量有明顯增加。該結果表明酸棗仁凍干粉可以延長大鼠睡眠時間，從而改善大鼠能量代謝異常形成的肥胖。

3.4 酸棗仁凍干粉對大鼠在24 h周期中能量代謝率干預作用機制的探究LEP、POMC和NPY是下丘腦中參與能量調控的重要因子。LEP對POMC有正向調控作用，LEP對NPY存在負向調控作用，當缺乏睡眠時，大鼠LEP分泌減少，抑食因子POMC含量下降，食欲促進因子NPY含量隨之升高，大鼠食物攝入量增加，導致體質量的增加。當給予酸棗仁凍干粉干預后，睡眠時間增加，大鼠LEP分泌增加，POMC含量增加，NPY含量下降，大鼠食物攝入量減少，體質量隨之下降。由此得出結論，酸棗仁通過改善大鼠睡眠狀態調節下丘腦內LEP、POMC、NPY含量，起到糾正機體能量代謝紊亂的作用。

基于上述，我們通過實驗發現，酸棗仁通過升高大鼠下丘腦內LEP和POMC含量，降低NPY含量使得大鼠的白天覺醒時間減少，睡眠時間增多，自主活動次數減少、產熱量增多。夜晚攝食量減少、產熱量增多，最終導致實驗動物體質量增加量的減少。從而糾正因持續黑暗條件導致的大鼠睡眠覺醒狀態紊亂及能量代謝率的異常。此外，本實驗應用凍干粉進行研究，低溫凍干對藥物中的揮發性成分損失很小，能排除藥物中95%以上的水分，利于藥物保存，且加水后能迅速完全溶解。與水煎液，浸膏等相比，應用低溫凍干將所需藥物一批次做完，其含量統一，且含量達到一定濃度，保證本次實驗藥效穩定性。