益氣補腎調脂方通過調控CDKN1A改善非酒精性脂肪性肝炎的研究

嚴峻彬，聶云夢，張婷婷，徐素美，陳芝蕓

(浙江中醫藥大學附屬第一醫院第二中心實驗室，浙江 杭州 310006)

非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis,NASH)是非酒精性脂肪肝病(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)的一個重要階段。有別于可以通過減脂逆轉的單純性脂肪變(nonalcoholic fatty liver,NAFL)[1]，NASH是更加危險的疾病階段[2]，會進一步惡化為肝硬化、肝衰竭及肝細胞癌[3]。大量研究提示，NASH的發病機制可能涉及肝臟炎癥、氧化應激、肝細胞衰老[4]，但NASH發病機制仍未完全闡明。目前，臨床缺乏特效藥，以對癥治療為主，包括使用維生素E(抗氧化劑)緩解NASH伴隨的氧化應激[5]。NASH在西醫治療中尚存不足。

根據臨床表型，NASH歸屬“肝癖”、“積聚”。2012年，中華中醫藥學會診斷專業委員會將其正式歸屬于“肝癖”的范疇[6]。中醫憑借獨特的整體觀念治療NASH，取得了較好的臨床療效。過食肥甘厚膩，耗傷脾胃，中焦運化失能，中氣虧虛，腎虛氣化不利，共致水濕內停，久而生痰，痰濕內蘊，生熱化瘀，最終痰、熱、瘀、濕糾結傷肝。益氣補腎，活血化瘀被視為中醫治療NASH的基本法則。補益脾腎以補氣行氣、化濕逐痰；活血化瘀以通暢血脈、消散瘀滯。益氣補腎調脂方(Yiqi-Bushen-Tiaozhi formula，YBTF)是課題組臨床長期用于治療NASH的經驗方，由黃芪、淫羊藿、茯苓、白術、海藻、郁金、桃仁、山楂、何首烏9味中藥組成。方中黃芪伍以茯苓、白術益氣健脾，補而不膩；淫羊藿、何首烏補腎益精；郁金活血行氣，兼以疏肝；海藻、桃仁輔以山楂共奏活血化瘀之功效；全方具有益氣健脾、補腎益肝、活血化瘀的作用。課題組前期研究證實，YBTF能通過抗氧化應激，減輕肝組織氧化損傷，改善高脂高糖誘導的NASH小鼠肝臟脂肪變及炎癥[7]；能直接改善西式飲食造成的小鼠肝損傷：谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)升高及脂質代謝紊亂：血清總膽固醇(CHOL)升高，血清甘油三酯(TG)降低，但對血清TG水平無明顯影響[8]。多年的臨床應用也證明，YBTF具有極佳的改善NASH的療效。但因復方多靶點、多途徑治療疾病的特點，尚不能明確YBTF治療NASH的確切機制。

網絡藥理學利用網絡數據庫，結合多學科技術內容，探究復方各味藥與疾病的關聯，明確中藥復方的有效成分及作用靶點，為研究中藥復方的治療機制提供新的角度。合理運用網絡藥理學有助于篩選復方治療疾病的靶點與機制。本研究通過網絡藥理學對YBTF的作用靶點及治療機制進行初步篩選，通過體內實驗進行驗證，試圖明確YBTF治療NASH的關鍵靶基因及信號通路，為YBTF的臨床推廣提供理論支持。

1 網絡藥理學分析及靶基因篩選

1.1 分析工具(Tab 1)

Tab 1 Public databases and analysis software used in study

1.2 篩選YBTF治療NASH的靶點

1.2.1篩選YBTF的活性成分與作用靶點 通過TCMSP數據庫以口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%及類藥性(drug-like，DL)≥0.18為篩選閾值，結合課題組前期HPLC-MS檢測的YBTF化學成分[8]，篩選YBTF的活性成分及作用靶點。利用 UniProt 數據庫進行作用靶點的名稱轉換。口服生物利用度反映藥物進入循環系統的速度及程度，類藥性則反應有效成分與已知藥物的相似性，兩者共為評價藥物內在質量的重要指標。

1.2.2篩選YBTF治療NASH的靶基因 通過GEO數據庫下載GSE89632數據集，篩選正常組與NASH組間的差異基因。篩選閾值為p.adjust<0.05，|logFC|>1。使用GeneCards、DisGeNET數據庫以“nonalcoholic steatohepatitis”為關鍵詞，檢索NASH相關疾病基因。將YBTF的作用靶點與差異基因、疾病基因取交集，交集基因為YBTF治療NASH的靶基因。

1.3 分析YBTF治療NASH的靶基因并篩選關鍵治療靶基因

1.3.1GO、KEGG、DO富集分析 使用R語言的R包org.Hs.eg.db將靶點基因的gene symbol轉換為對應的EntrezID，接著使用R包clusterProfiler[9]進行基因本體論(Gene ontology,GO)、京都基因與基因組百科全書 (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)、疾病本體論(Disease ontology,DO)富集分析。篩選條件為p.adjust<0.05，q<0.05。根據富集分析結果，明確YBTF治療靶基因的基因功能及涉及的信號通路。

1.3.2構建蛋白質互作網絡及網絡拓撲分析 使用Cytoscape 3.8.0軟件插件BisoGenet結合篩選到的YBTF治療NASH的靶基因構建蛋白質互作網絡。使用插件CytoNCA進行網絡拓撲分析，依次根據條件度中心性(degree centrality，DC)≥30及中介中心性(betweenness centrality，BC)≥30構建子網絡，篩選位于核心網絡的關鍵靶基因。

1.3.3篩選YBTF的關鍵治療靶基因 通過GO、KEGG富集分析結果明確YBTF靶基因的基因功能及涉及的通路。結合蛋白互作網絡及網絡拓撲分析篩選出的位于核心子網絡以及在蛋白互作中發揮關鍵作用的靶基因。

2 靶基因篩選結果的驗證

2.1 分子對接驗證使用Autodock軟件根據蛋白結構，將YBTF治療NASH的關鍵靶基因與YBTF的關鍵活性成分進行分子對接，以判斷兩者能否順利結合，發揮療效。通過有機小分子生物活性數據庫下載配體(YBTF關鍵活性成分)的3D結構；通過蛋白質結構數據庫下載受體(YBTF關鍵靶基因)的蛋白結構。對受體蛋白進行加氫，去除水分子的處理，同時設置活性口袋，進行分子對接。

2.2 動物實驗驗證

2.2.1實驗主要試劑(Tab 2)

Tab 2 The main reagents used in experiment

2.2.2實驗動物分組 24只雄性C57BL/6小鼠(購自于上海西普爾-必凱實驗物有限責任公司；許可證號：SCXK(滬)2013-0016；飼養于浙江中醫藥大學動物實驗中心)適應性飼養1周后隨機分成正常組(Normal diet，ND)、西式飲食組(Western diet，WD)、YBTF治療組(YBTF treatment，YBTF)，每組8只。ND組小鼠予以正常飼料(蛋白質占0.215，脂肪占0.123，碳水化合物占0.662)，并自由飲水。WD、YBTF組小鼠予以高脂高糖的西式飲食(豬油占0.10，蛋黃粉占0.05，膽固醇占0.02，膽鹽占0.005，基本飼料占0.825；基本飼料構成：蛋白質占0.216，脂肪占0.361，碳水化合物占0.423)，并自由飲用質量分數為20%的果糖水。其中，第5周起，YBTF組小鼠每天予以22.80 g·kg-1的YBTF流浸膏(浙江中醫藥大學附屬第一醫院中藥制劑中心制備)灌胃干預治療,YBTF藥物構成詳見Fig 1。同時給予其他組小鼠相同體積的0.9% NaCl。第16周末處死所有小鼠，實驗前小鼠禁食12 h(飲水不受限)。空腹麻醉下取血，分離血清待用；分離肝臟,部分以4%多聚甲醛固定,常規石蠟包埋待用。其余肝組織放入液氮2 h后凍存于-80 ℃冰箱中待用。本次動物實驗得到浙江中醫藥大學倫理委員會的批準(決議號：ZSLL-2016-139)。

Fig 1 Chinese herbs of Yiqi-Bushen-Tiaozhi formula

2.2.3小鼠肝組織病理檢測 油紅O染色(Oil-red O staining)和蘇木精-伊紅染色(HE staining)檢測小鼠肝組織病變。

2.2.4β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色檢測小鼠肝組織衰老 小鼠肝組織石蠟切片按照常規方法進行脫蠟、水化。配置β-半乳糖苷酶染色液。肝組織切片加入適量染色液，無CO2的37 ℃培養箱中孵育14 h。光鏡(200×)觀察染色結果。

2.2.5Western blot檢測肝組織CDKN1A蛋白表達水平 使用普利來全蛋白提取試劑盒提取小鼠肝組織的蛋白；使用BCA法進行蛋白定量,結果為20 g·L-1。加2×SDS上樣緩沖液并95 ℃變性后-80 ℃保存。使用10% SDS-PAGE膠，每孔80 μg上樣，200 V恒壓電泳40 min，恒流200 mA轉膜90 min；發光筆涂抹marker，使用5%小牛血清室溫封閉1 h后，加入相應一抗CDKN1A(1 ∶800)，GAPDH(1 ∶5 000)，4 ℃冰箱過夜；TBST洗膜后加入相應的抗兔或抗鼠二抗(1 ∶5 000)，室溫孵育1 h；TBST洗膜后以ECL在FCE型ProteinSimple化學發光成像系統進行曝光顯影，AlphaView SA 3.3.0.0軟件分析灰度值，采用目的蛋白灰度值/GAPDH灰度值代表目的蛋白的相對表達量。

2.2.6qRT-PCR檢測肝組織CDKN1A mRNA表達 使用RNAiso Plus試劑盒提取肝組織總RNA；采用Evo M-MLV反轉錄預混型試劑盒以500 ng總RNA為模板合成cDNA，以下列反應體系進行PCR反應：2×SYBR 5 μL、10 μmol·L-1上下引物各0.4 μL、10 μg·L-1的cDNA模板2 μL、加雙蒸水(double distilled H2O，ddH2O)補充體積至10 μL，PCR反應條件：95 ℃預性5 min，再95 ℃ 15 s，60 ℃ 45 s，循環擴增40次，溶解曲線分析：95 ℃×15 s，60 ℃×5 s，緩慢上升至95 ℃×15 s。以β-actin為內參，相對表達量(2-△△Ct)來表示目的基因CDKN1A的mRNA表達水平。基因引物由生工生物工程(上海)有限公司設計并合成 (Tab 3)。

Tab 3 List of qRT-PCR primer

3 結果

3.1 YBTF活性成分及治療靶基因的篩選TCMSP中無法檢索到山楂、何首烏，因此使用中醫百科全書數據庫(ETCM)搜索山楂、何首烏的活性成分及作用靶點。結果顯示YBTF共有223個作用靶點，105個活性成分。在105個活性成分中，只有75個活性成分具有對應得作用靶點，其中淫羊藿、桃仁、黃芪的活性成分數量位列前三(Fig 2A)。HPLC-MS檢測結果則顯示YBTF的主要化學成分包括有機氧化物、黃酮類及異黃酮類化合物。分析后發現槲皮素(quercetin)、常春藤皂苷元(hederagenin)等活性成分同時存在于多味中藥中，是YBTF發揮療效的重要活性成分(Tab 4)。GSE89632數據集中共有19個NASH樣本，24個正常樣本，篩選得到195個差異基因(Fig 2B)。GeneCards、DisGeNET數據庫共篩選出NASH疾病基因748個(Fig 2Ca)；三者的交集基因PTGS2、CDKN1A、IL6、IL1β被視作YBTF治療NASH的治療靶基因(Fig 2Cb)。

Fig 2 Analysis of YBTF active ingredients and screening of target genesA.Screening results of YBTF active ingredients;B.Screening results of differentially expressed genes;C.Screening results of YBTF target genes

Tab 4 Top 5 crucial ingredients of YBTF

3.2 GO、KEGG、DO富集結果分析GO富集分析主要包括細胞組分(cellular component,CC)、分子功能(molecular function,MF)、生物過程(biological process,BP)。共計富集到符合篩選條件的生物過程10條，分子功能10條與細胞組分6條(Fig 3A)。分析后發現YBTF治療靶基因的基因功能多與細胞周期、細胞增殖、氧化應激以及炎癥反應相關。KEGG富集分析共富集到93條通路，其中富集到多個基因(基因數量≥2)的通路共計49條，篩選可信度最高的前20條通路進行可視化(Fig 3B)。結果顯示YBTF的治療靶基因多涉及炎癥、細胞周期相關通路。結合GO、KEGG富集分析的結果,考慮YBTF的治療靶基因多參與細胞周期、炎癥的調控。DO富集分析共富集到505個與YBTF治療靶基因相關的疾病，篩選與4個關鍵靶基因均密切相關的DO富集分析結果進行可視化(Fig 3C)。其中紅色條柱是肝臟炎癥相關疾病，結果顯示與上述YBTF治療靶基因關系最為密切的肝臟疾病包括肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎，提示PTGS2、CDKN1A、IL6、IL1β可能是與肝組織炎癥相關的疾病基因。

Fig 3 Enrichment analysis resultsA.GO enrichment analysis results;B.KEGG enrichment analysis results;C.DO enrichment analysis results

3.3 蛋白質互作網絡及網絡拓撲分析結果使用Cytoscape 3.8.0軟件的插件BisoGenet、CytoNCA以YBTF治療靶基因為基礎構建蛋白質互作網絡，通過節點度(Degree)≥30及介數中心度(Betweenness)≥30構建子網絡，篩選出位于核心位置基因(Tab 5)。結果顯示CDKN1A是YBTF所有治療靶基因中唯一一個位于核心子網絡中的基因，將其視為是YBTF治療NASH的關鍵靶基因。

Tab 5 Hub genes in network topology analysis

3.4 篩選YBTF的關鍵靶基因GO、KEGG富集分析結果顯示，YBTF的治療靶基因多參與細胞周期、炎癥的調控。蛋白互作網絡及網絡拓撲分析顯示在所有YBTF治療NASH的治療靶基因中，只有CDKN1A位于網絡的核心位置，是關鍵靶基因。結合文獻發現，CDKN1A可以調控細胞衰老，是直接反映細胞衰老的標志。基于此，提出假設YBTF通過靶向CDKN1A，改善肝細胞的細胞衰老，治療NASH。

3.5 分子對接驗證結果網絡藥理學分析結果顯示CDKN1A是YBTF治療NASH的關鍵靶基因，槲皮素、常春藤皂苷元、β-谷甾醇是YBTF發揮療效的關鍵活性成分(篩選出現頻率排名前三的活性成分視為關鍵成分)。因此，使用Autodock軟件進行分子對接，Pymol、Discovery Studio 2016軟件用于結果可視化，驗證YBTF發揮療效的關鍵有效成分能否與YBTF的關鍵靶基因CDKN1A實現對接。分別從PDB數據庫下載CDKN1A的蛋白質結構(PDB ID ：2ZVV)；從PubChem數據庫下載皮素、常春藤皂苷元、β-谷甾醇的3D結構。小分子配體能否與大分子蛋白結合主要通過結合能進行判斷，結合能小于0，說明配體能自發和受體結合，結合能數值越小表示配體與受體的結合能力越強，提示活性成分越容易與靶基因結合，發揮療效。CDKN1A與槲皮素、常春藤皂苷元、β-谷甾醇的最低自由結合均小于0(Tab 6)。槲皮素、常春藤皂苷元、β-谷甾醇均能與YBTF的治療NASH的關鍵靶點CDKN1A實現對接，提示YBTF的重要活性成分槲皮素、常春藤皂苷元、β-谷甾醇可能可以作用于CDKN1A，改善細胞衰老(Fig 4)。

Fig 4 The docking results of CDKN1A with quercetin,hederagenin,and β-sitosterola.The chemical bond results of the docking of CDKN1A with quercetin (2D);b.The chemical bond results of the docking of CDKN1A with hederagenin (2D);c.The chemical bond results of the docking of CDKN1A with β-sitosterol (2D);d.Docking result of CDKN1A with quercetin (3D);e.Docking result of CDKN1A with hederagenin (3D);f.Docking result of CDKN1A with β-sitosterol (3D)

Tab 6 Molecular docking results of crucial ingredients of YBTF and CDKN1A

3.6 動物實驗驗證結果

3.6.1YBTF能顯著改善NASH小鼠的炎癥及脂肪變 油紅O染色的結果表明，WD組小鼠的肝臟脂質堆積水平遠高于ND組小鼠。相較于WD組小鼠，YBTF處理的小鼠肝臟異常脂質堆積明顯改善。HE染色結果表明，WD組小鼠肝組織的炎癥細胞浸潤較ND組小鼠更嚴重。YBTF干預組小鼠肝臟炎性細胞浸潤程度較WD組小鼠明顯改善(Fig 5)。提示YBTF能顯著改善NASH小鼠的炎癥及脂肪變。

Fig 5 Results of Oil-red O and HE staining(100×)

3.6.2β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色檢測小鼠肝組織衰老 觀察染色結果表明，ND組未見明顯β-半乳糖苷酶染色深藍色產物，WD組小鼠肝組織深藍色產物顯著增多；YBTF干預組小鼠肝組織β-半乳糖苷酶染色陽性則較WD組小鼠明顯改善(Fig 6)。結果提示NASH小鼠肝組織伴隨細胞衰老，YBTF能明顯改善細胞衰老。同時發現衰老細胞多集中于脂肪變細胞周邊，提示脂肪變與細胞衰老之間可能存在密切關聯。

Fig 6 Results of SA-β-Gal staining(200×)

3.6.3Western blot檢測肝組織CDKN1A蛋白表達水平 相較于予以正常飼料的ND組小鼠，給予西式飲食喂養的WD組小鼠CDKN1A表達量明顯升高(P<0.05)。其中，從第5周起,每天予以22.80 g·kg-1的益氣補腎調脂方流浸膏治療的YBTF組小鼠肝臟CDKN1A表達量較WD組明顯降低(P<0.05)(Fig 7)。結果提示持續攝入高糖高脂的西式飲食在造成NASH小鼠模型的同時更會導致CDKN1A表達上調，YBTF干預治療可逆轉該過程。

Fig 7 Results of Western blot *P<0.05 vs ND;#P<0.05 vs WD

3.6.4qRT-PCR檢測肝組織CDKN1A mRNA表達 課題組前期分別各選取ND、WD、YBTF組3只小鼠的肝組織進行基因組測序[9]。分析發現WD組小鼠，CDKN1A表達量較ND組小鼠明顯上升，YBTF干預治療后表達量明顯下降(P<0.01)(Fig 8A)。qRT-PCR實驗結果也顯示，在WD小鼠中CDKN1A mRNA表達量異常升高，YBTF干預治療可以有效地降低CDKN1A mRNA表達量(P<0.05)(Fig 8B)。

Fig 8 Results of sequencing and qRT-PCR **P<0.01 vs ND;#P<0.05,##P<0.01 vs WD

4 討論

YBTF是課題組臨床長期使用中藥復方，具有極佳的改善NASH的療效。課題組已通過miRNA測序結合實驗明確YBTF可以通過改善炎癥、免疫、氧化應激治療NASH小鼠[8]，但未明確YBTF發揮療效的具體作用靶點。網絡藥理學從中藥復方單位藥的活性成分、作用靶點入手研究，通過構建網絡的方式篩選復方治療疾病的作用靶點，研究方式貼合中藥復方多靶點、多途徑的治療原則。因此本研究通過網絡藥理學結合GO、KEGG富集分析篩選YBTF治療NASH的作用機制及靶基因，伍以分子對接、WB、qRT-PCR對篩選結果進行驗證。

結果顯示YBTF可以治療NASH，關鍵作用靶基因是CDKN1A，又名P21。諸多研究證實，當細胞端粒出現DNA損傷時，CDKN1A能夠通過抑制細胞周期蛋白依賴性激酶的活性，引起細胞周期停滯，進行DNA修復,使細胞恢復穩態[10]。但CDKN1A的過表達則會導致細胞周期阻滯，從而出現一系列細胞衰老的征象[11]，通過靶向抑制CDKN1A的表達可顯著改善細胞衰老[12]。CDKN1A與細胞衰老密切相關，是公認的細胞衰老標志。

細胞衰老是在各種應激因子誘導下出現的一種細胞周期停滯且不可逆的狀態。常見的誘導因素包括端粒功能障礙，遺傳毒性及氧化應激等。其中，細胞端粒縮短是細胞衰老的常見原因。數次分裂后，由于端粒縮短，細胞激活p53、p21、pRb等途徑，從而導致生長停滯及細胞衰老。越來越多的證據表明，衰老是導致NASH惡化的重要危險因素[13]。實驗證明細胞衰老可誘導線粒體功能障礙，破壞脂質代謝，導致脂質在肝細胞中過度堆積，造成脂肪變[14]。同時，線粒體功能障礙也會導致活性氧(reactive oxygen species，ROS)的生成[15]。過多的ROS會引起肝臟異常炎癥以及NASH的惡化。動物實驗發現，予以相同飲食的條件下，不同于抗肥胖組，易肥胖組小鼠肝組織脂肪變更嚴重，同時細胞衰老相關基因p16、p21 mRNA水平也明顯高于抗肥胖組小鼠[16]。體外研究證實，抑制肝細胞中細胞衰老相關基因p53的表達可改善細胞凋亡和脂肪變[17]。臨床實驗也發現，NAFLD患者肝組織中p53的表達顯著高于正常組[18]。上述實驗均證明肝細胞衰老會促進肝細胞脂肪變及炎癥，造成NASH的惡化，也進一步為YBTF以CDKN1A為關鍵靶基因，改善肝細胞衰老，治療NASH的機制提供了理論支持。

YBTF是課題組長期用于治療NASH的驗方，臨床療效顯著。但因YBTF多途徑、多靶點治療NASH的特點，YBTF的治療機制尚不明確，阻礙了YBTF的臨床推廣。網絡藥理學是合適的用于篩選中藥復方治療疾病的靶點、機制的工具。本次研究通過網絡藥理學篩選YBTF治療NASH的作用靶點，通過動物實驗完成驗證，流程完整；明確YBTF通過改善肝細胞衰老治療NASH的機制及關鍵靶基因CDKN1A，篩選結果精準。為臨床應用YBTF治療NASH提供理論支撐。后續實驗將進一步明確YBTF對CDKN1A上、下游基因的調控作用，篩選YBTF改善肝細胞衰老，治療NASH的作用通路，研究肝細胞脂肪變與細胞衰老之間的關聯。