LncRNA GAS5靶向miR-103減輕3T3L1脂肪細胞胰島素抵抗的作用機制

敖文，徐在革，白楊，劉惠雙

隨著經濟發展、人口老齡化加劇，2型糖尿病的患病率呈迅速升高趨勢，已成為繼腫瘤、心血管疾病之后的第3大死亡誘因［1］。2型糖尿病發病機制主要為胰島素抵抗（insulin resistance，IR）和胰島素分泌不足，其中IR貫穿疾病整個階段［2-3］。控制和改善IR是預防和治療糖尿病的根本。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，LncRNA）可以通過多條途徑靶向調控胰島素相關基因表達，從而影響IR的形成以及胰島素的合成、分泌，這為治療糖尿病提供了新思路［4］。生長抑制特異因子5（growth arrestspecific 5，GAS5）在2型糖尿病患者血清中呈低表達，GAS5可結合胰島素受體啟動子，其缺失可抑制葡萄糖攝取和胰島素信號轉導［5］。微小RNA（microRNA，miRNA）亦參與IR過程，miR-103作為2型糖尿病的潛在標志物，對預測2型糖尿病預后具有較高的價值［6］。另有研究發現，GAS5與miR-103之間存在靶向結合位點［7］。GAS5是否通過miR-103在IR中發揮作用尚不明確。本研究通過腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α誘導3T3L1脂肪細胞建立IR模型，探究GAS5對IR的影響，并初步探討其可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 3T3L1小鼠前脂肪細胞購自中國科學院典型培養物保藏委員會昆明細胞庫（編號：KCB 92010YJ）。胰島素、地塞米松、異丁基甲基黃嘌呤（IBMX）、TNF-α（美國sigma公司）；pEGFP-C1-GAS5、引物均由上海生工生物有限公司合成；Lipofectamine?3000、mimic NC、miR-103 mimic由廣州銳博生物有限公司合成；Krebs-Ringer緩沖液（北京Solarbio公司）；一抗胰島素受體底物-1（insulin receptor substrate-1，IRS-1）、p-IRS-1、過氧化物酶體增殖物激 活 受 體γ（peroxisome proliferator-activated receptorγ，PPARγ）、葡萄糖轉運蛋白4（glucose transporter protein 4，GLUT4）、蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）、p-AKT、βactin，羊抗兔二抗，雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒（英國abcam公司）；實時熒光定量PCR（real-time quantitative PCR，qPCR）儀（美國ABI公司，型號：QuantStudio 3）；全自動凝膠成像分析系統（上海Tanon公司，型號：4100）。

1.2 研究方法

1.2.1 細胞培養及模型建立 3T3L1小鼠前脂肪細胞在10%胎牛血清DMEM培養液中置于37℃、5%CO2培養箱中培養、傳代，待細胞密度達70%，參考文獻［8］添加含10 mg/L胰島素、1μmol/L地塞米松、0.5 mmol/L IBMX的10%胎牛血清DMEM培養液誘導分化48 h，含10 mg/L胰島素的DMEM培養液繼續培養48 h，10%胎牛血清DMEM培養液再繼續培養4 d，油紅O染色鑒定細胞分化情況。添加10 ng/L TNF-α繼續培養24 h，建立3T3L1脂肪細胞IR模型。

1.2.2 細胞分組 實驗分為對照組、模型組、空載體組、GAS5過表達組、GAS5過表達+mimic NC組、GAS5過表達+miR-103 mimic組。對照組為3T3L1脂肪細胞，其余各組細胞為IR模型細胞，空載體組、GAS5過表達組、GAS5過表達+mimic NC組、GAS5過表達+miR-103 mimic組參考Lipofectamine?3000說明書分別轉染pEGFP-C1空載體、pEGFP-C1-GAS5、pEGFP-C1-GAS5+mimic NC、pEGFP-C1-GAS5+miR-103 mimic，轉染6 h。

1.2.3 qPCR檢測細胞中GAS5、miR-103mRNA水平 收集轉染并培養后的各組細胞，每組各收集3孔，每孔1 mL，每孔各加1 mL Trizol試劑，Trizol法提取細胞總RNA，cDNA合成試劑盒合成cDNA，qPCR檢測細胞中GAS5、miR-103mRNA水 平。GAS5引 物：上 游5′-AAGCCATTGGCACACAG?GCATTAG-3′，下游5′-AGAACCATTAAGCTGGTCCAGGCA-3′；β-actin引物：上游5′-CTACAATGAGCTGCGTGTGG-3′，下游5′-AAGGAAGGCTGGAACAGTGC-3′；miR-103引物：上游5′-AGCAGCATTGTACAGGGCTATGAA-3′，下 游5′-TG?GTGTCGTGGAGTCG-3′；U6引物：上游5′-CGCTTCGGCAG?CAGCACATATAC-3′，下游5′-AATTTGCGTGTCATCCTTGC-3′。反應體系（20μL）：1μL cDNA（200μg/L）、10μL 2×SYBR qPCR Mix、上游引物/下游引物（均為10μmol/L）0.5 μL/0.5μL，8μL ddH2O；反應條件：94℃60 s；95℃30 s，60℃30 s，40個循環。2-ΔΔCt法計算GAS5、miR-103mRNA相對表達水平。

1.2.4 液體閃爍法檢測葡萄糖攝取能力 實驗前1 d各組置于24孔板中，均用含0.2%胎牛血清白蛋白的無血清DMEM培養液培養過夜，用含0.2%胎牛血清白蛋白的Krebs-Ringer緩沖液作用2 h，每孔添加50μL含有1.85×105Bq（約5μCi）2-脫氧3［H］葡萄糖的2-脫氧葡萄糖混合液孵育5 min，磷酸鹽緩沖液清洗，干燥后室溫添加500μL Triton X-100裂解細胞30 min，取400μL裂解液于液閃計數器下檢測葡萄糖攝取量。

1.2.5 Western blot檢測細胞中IRS-1、p-IRS-1、PPARγ、GLUT4、AKT、p-AKT蛋白相對表達水平 磷酸鹽緩沖液清洗細胞，添加蛋白裂解酶冰上裂解細胞10 min，收集至1.5 mL的EP管中，4℃、12 000 r/min離心20 min，收集上清液至新的EP管中即為總蛋白。BCA試劑盒測定蛋白濃度，每孔上樣20μg，聚丙烯酰胺凝膠分離蛋白、NC轉膜、5%脫脂奶粉室溫封閉NC膜2 h，對應一抗IRS-1、p-IRS-1、PPARγ、GLUT4、AKT、p-AKT（稀釋比例均為1∶300）、β-actin（1∶500），4℃孵育過夜；加入羊抗兔二抗（1∶1 000）室溫孵育1 h，顯色液避光顯色，全自動凝膠成像分析系統檢測蛋白表達情況。

1.2.6 雙熒光素酶鑒定miR-103與GAS5的靶向位點 生物信息學在線網站Targetscan（http://www.targetscan.org/）預測miR-103與GAS5存在互補的結合位點；將miR-103與GAS5結合位點及突變位點的序列克隆重組至pGL3-basic熒光素酶報告載體上構建GAS5野生型（GAS5 WT）及突變型（GAS5 MUT）熒光素酶報告載體，分別與miR-103 mimic或mimic NC共轉染至3T3L1脂肪細胞中，雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測熒光素酶相對活性。

1.3 統計學方法 采用GraphPad Prim 8.0軟件進行數據分析。符合正態分布的計量資料以±s表示，多組間比較行單因素方差分析，組間多重比較行SNK-q檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3T3L1脂肪細胞分化情況 誘導前，脂肪細胞呈梭形，與成纖維細胞形態類似，突觸伸展于細胞間隙形成網狀，細胞質中未見紅色脂滴；誘導后，脂肪細胞呈圓形、胞體變大，胞漿豐富，含有大量脂滴，油紅染色明顯，呈“指環樣”結構，模型構建成功，見圖1。

Fig.1 The establishment of 3T3L1 adipocyte models(Oil red O staining,×400)圖1 3T3L1脂肪細胞模型制作（油紅O染色，×400）

2.2 各組GAS 5、miR-103mRNA水平比較 與對照組比較，其他各組細胞中GAS 5mRNA水平降低，模型組、空載體組、GAS5過表達+miR-103 mimic組細胞中miR-103mRNA水平升高（P＜0.05）；與模型組、空載體組比較，GAS5過表達組、GAS5過表達+mimic NC組細胞中GAS5mRNA水平升高，而miR-103mRNA水平降低（P＜0.05）；與GAS5過表達組、GAS5過表達+mimic NC組比較，GAS5過表達+miR-103 mimic組細胞中GAS5mRNA水平降低，miR-103mRNA水平升高（P＜0.05），見表1。

Tab.1 Comparison of GAS5,miR-103 mRNA levels and glucose uptake capacity between 6 groups of cells表1 6組細胞中GAS5、miR-103 mRNA水平和葡萄糖攝取能力比較 （n=6，±s）

Tab.1 Comparison of GAS5,miR-103 mRNA levels and glucose uptake capacity between 6 groups of cells表1 6組細胞中GAS5、miR-103 mRNA水平和葡萄糖攝取能力比較 （n=6，±s）

＊＊P＜0.01，a與對照組比較，b與模型組比較，c與空載體組比較，d與GAS5過表達組比較，e與GAS5過表達+mimic NC組比較，P＜0.05；模型組、空載體組均不與GAS5過表達+miR-103 mimic組比較，未標注。

組別對照組模型組空載體組GAS5過表達組GAS5過表達+mimic NC組GAS5過表達+miR-103 mimic組F GAS5 mRNA 1.01±0.09 0.36±0.05a 0.35±0.06a 0.87±0.08abc 0.86±0.07abc miR-103 mRNA 0.99±0.08 3.47±0.32a 3.44±0.34a 1.39±0.15bc 1.40±0.15bc葡萄糖攝取（cpm）1 356.39±146.48 675.43±73.91a 684.79±76.36a 1 241.88±147.69bc 1 237.75±134.82bc 0.47±0.05ade 2.67±0.25ade 867.49±92.36ade 110.194＊＊132.922＊＊41.075＊＊

2.3 各組葡萄糖攝取能力比較 與對照組比較，模型組、空載體組、GAS5過表達+miR-103 mimic組細胞葡萄糖攝取能力降低（P＜0.05）；與模型組、空載體組比較，GAS5過表達組、GAS5過表達+mimic NC組細胞葡萄糖攝取能力提高（P＜0.05）；與GAS5過表達組、GAS5過表達+mimic NC組比較，GAS5過表達+miR-103 mimic組細胞葡萄糖攝取能力降低（P＜0.05），見表1。

2.4 各組IRS-1、p-IRS-1、PPARγ、GLUT4、AKT、p-AKT蛋白相對表達水平比較 與對照組比較，模型組、空載體組、GAS5過表達+miR-103 mimic組細胞中p-IRS-1/IRS-1、PPARγ、GLUT4、p-AKT/AKT蛋白水平降低，GAS5過表達組、GAS5過表達+mimic NC組細胞中PPARγ、GLUT4蛋白水平降低（P＜0.05）；與模型組、空載體組比較，GAS5過表達組、GAS5過表達+mimic NC組細胞中p-IRS-1/IRS-1、PPARγ、GLUT4、p-AKT/AKT蛋白水平升高（P＜0.05）；與GAS5過表達組、GAS5過表達+mimic NC組比較，GAS5過表達+miR-103 mimic組細胞中p-IRS-1/IRS-1、PPARγ、GLUT4、p-AKT/AKT蛋白水平降低（P＜0.05）。見圖2、表2。

Fig.2 Protein levels of IRS-1,p-IRS-1,PPARγ,GLUT4,AKT,and p-AKT in 6 groups of cells圖2 各組細胞中IRS-1、p-IRS-1、PPARγ、GLUT4、AKT、p-AKT蛋白相對表達水平

2.5 miR-103與GAS5的靶向位點驗證 生物信息學分析miR-103與GAS5存在互補的結合位點，見圖3。mimic NC+GAS5 WT組、miR-103 mimic+GAS5 WT、mimic NC+GAS5 MUT、miR-103 mimic+GAS5 MUT的熒光素酶相對活性分別為1.01±0.12、0.48±0.06、0.99±0.08、0.98±0.11，差異有統計學意義（n=6，F=43.419，P＜0.05），其中與mimic NC+GAS5 WT比較，miR-103 mimic+GAS5 WT熒光素酶相對活性下降（P＜0.05）；mimic NC+GAS5 MUT與miR-103 mimic+GAS5 MUT熒光素酶相對活性差異無統計學意義（P＞0.05）。

Fig.3 Targeting sites of miR-103 and GAS5圖3 miR-103與GAS5的靶向位點

3 討論

目前，臨床主要通過胰島素增敏劑噻唑烷二酮類藥物改善IR，促進前脂肪向脂肪轉化、增加細胞內游離脂肪酸的含量和細胞內三酰甘油的積聚，從而降低血漿游離脂肪酸水平，增加組織對胰島素的敏感性［9-10］；但會增加患者饑餓感，促進患者飲食，導致體質量和體脂比例增加，造成肥胖［11］。因此，尋找能調控IR的基因，避免藥物影響，對IR相關疾病治療可能更有意義。本研究結果顯示，制備IR模型后，與對照組比較，模型組細胞中GAS5mRNA水平降低、miR-103mRNA水平升高，表明IR模型中GAS5、miR-103基因表達水平發生改變，提示在IR中基因表達水平變化可能影響疾病，改變基因表達水平可能作為新的治療方法。

LncRNA已成為生物學研究熱點之一，其參與IR發生、發展，成為代謝疾病發展過程中肝臟IR的精確指標，可用于IR相關疾病的早期診斷和治療［12］。過表達H19可通過靶向調節異質性胞核核糖核蛋白A1，促進脂肪酸氧化，進而減少骨骼肌中異位脂質積累，改善IR［13］。GAS5位于1q25.1染色體上，在生長停滯成纖維細胞內首次被發現，靶向提高GAS5水平，可增加脂肪細胞中胰島素受體的表達［14］。GAS5作為糖皮質激素受體擬似物，通過競爭性結合糖皮質激素，達到抑制糖皮質激素的生物學效應目的，而糖皮質激素對IR具有促進作用［15］。本研究結果顯示，與模型組比較，GAS5過表達組細胞中GAS5mRNA表達水平、葡萄糖攝取能力、細胞中p-IRS-1/IRS-1、PPARγ、GLUT4、p-AKT/AKT蛋白水平升高，表明GAS5過表達可提高細胞的葡萄糖攝取能力，提示該作用可能與IRS-1相關蛋白表達水平有關。IRS-1作為胰島素信號通路連接細胞外蛋白，其活化水平影響胰島素的生理效應，IR發生時，受炎癥、高胰島素血癥影響，IRS-1磷酸化減弱，胰島素信號通路被抑制，進一步加重IR［16］。PPARγ是活化配體的核受體超家族的一個成員，在IR時水平降低，具有胰島素增敏功能；PPARγ直接調控的下游靶蛋白GLUT4在IR時下調，可減少細胞對葡萄糖轉運攝取，引發脂肪IR［17］。Feng等［18］研究顯示，IRS-1/PI3K/AKT信號通路在糖原合成、葡萄糖轉運中發揮重要作用，上調IRS-1、AKT的磷酸化水平，可促進胰島素信號轉導，減輕IR引起的肝損傷。本研究亦顯示，GAS5能夠促進p-IRS-1/IRS-1、PPARγ、GLUT4、p-AKT/AKT蛋白表達，恢復胰島素信號轉導，減輕IR。

Tab.2 Comparison of protein levels of IRS-1,p-IRS-1,PPARγ,GLUT4,AKT and p-AKT between 6 groups of cells表2 6組細胞中IRS-1、p-IRS-1、PPARγ、GLUT4、AKT、p-AKT蛋白水平比較 （n=6，±s）

Tab.2 Comparison of protein levels of IRS-1,p-IRS-1,PPARγ,GLUT4,AKT and p-AKT between 6 groups of cells表2 6組細胞中IRS-1、p-IRS-1、PPARγ、GLUT4、AKT、p-AKT蛋白水平比較 （n=6，±s）

＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與模型組比較，c與空載體組比較，d與GAS5過表達組比較，e與GAS5過表達+mimic NC組比較，P＜0.05；模型組、空載體組均不與GAS5過表達+miR-103 mimic組比較，未標注。

組別對照組模型組空載體組GAS5過表達組GAS5過表達+mimic NC組GAS5過表達+miR-103 mimic組F IRS-1 1.19±0.12 1.21±0.11 1.16±0.15 1.20±0.13 1.22±0.14 1.19±0.13 0.151 p-IRS-1/IRS-1 0.88±0.09 0.57±0.06a 0.59±0.05a 0.79±0.08bc 0.80±0.08bc 0.66±0.07ade 18.000＊＊PPARγ 1.43±0.15 0.86±0.09a 0.88±0.07a 1.21±0.13abc 1.20±0.13abc 0.97±0.09ade 23.580＊＊GLUT4 1.36±0.15 0.48±0.05a 0.49±0.06a 0.87±0.08abc 0.84±0.09abc 0.59±0.07ade 83.683＊＊AKT 0.88±0.09 0.89±0.10 0.86±0.11 0.84±0.09 0.90±0.09 0.91±0.07 0.477 p-AKT/AKT 0.68±0.07 0.45±0.06a 0.46±0.07a 0.62±0.07bc 0.63±0.06bc 0.51±0.04ade 14.548＊＊

miRNA在IR中發揮重要作用，miR-103為GAS5靶位點之一，可影響IR，并通過抑制PI3K/AKT通路的激活，引起多囊卵巢綜合征、肥胖、胰島素抵抗、雄激素過多、不孕等［19］。miR-103在抑郁癥合并IR中與IR指數、抑郁嚴重程度呈正相關，且為IR指數的影響因素［20］。在本研究中，雙熒光酶靶向關系結果證實，miR-103是GAS5的靶位點，升高GAS5的表達能夠降低miR-103的表達，在升高GAS5的基礎上過表達miR-103能夠降低葡萄糖攝取，降低細胞中p-IRS-1/IRS-1、PPARγ、GLUT4、p-AKT/AKT蛋白表達水平，且miR-103在IR時高表達；miR-103能夠逆轉GAS5功能，提示在脂肪細胞IR中GAS5低表達，升高GAS5的表達能夠靶向抑制miR-103的表達，從而緩解脂肪細胞IR。

綜上所述，升高GAS5的表達能夠抑制脂肪細胞IR，可能與靶向抑制miR-103有關，但miR-103的下游靶基因較多，其具體靶向蛋白尚需進一步研究。