重癥急性胰腺炎大鼠血漿中6種線粒體N-甲酰肽及胰腺FPR1的表達研究

肖懿，張桂賢，高瑞芳，李霞，沈洪昇，劉洪斌△

重癥急性胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP）作為一種病死率極高的急性胰腺炎（AP），不僅具備AP的臨床表現和生化改變，還伴有持續（＞48 h）器官功能衰竭［1］。損傷相關分子模式（damage associated molecular patterns，DAMPs）是指發生創傷或嚴重失血等情況時被釋放到細胞間隙或血液循環中的一類物質［2］。胞內來源的線粒體DAMPs分子包括線粒體N-甲酰肽（N-formyl peptides，NFPs）和線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）。研究發現SAP模型大鼠血漿mtDNA濃度顯著升高，并與多器官損傷程度密切相關［3］。MT-ND1、MT-ND2、MT-ND3、MT-ND4、MT-ND5和MT-ND6均屬于人線粒體基因組所編碼的人源線粒體NFPs的氨基酸序列。甲酰肽受體（formyl peptide receptors，FPRs）屬于7次跨膜G蛋白偶聯受體家族［4］，參與并調控多種炎癥性疾?。?］。人體內有3種FPRs，分別是FPR1、FPR2和FPR3［6］。線粒體NFPs作為主要的促炎介質，可被FPR1和FPR2所識別。已知NFPs可作用于中性粒細胞表面FPR1，激活中性粒細胞的免疫功能［7］。目前，探討FPR1和炎癥關系的研究頗多，但線粒體NFPs和FPR1與SAP的關系尚不明確。本研究以6種線粒體NFPs及FPR1為切入點，初步探究SAP進程中其相關表達情況，為拮抗SAP病程中的炎癥級聯反應尋找潛在治療靶點。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 牛磺膽酸鈉購自Sigma公司；全血總蛋白提取試劑盒（TF211148）購自北京百奧萊博科技有限公司；BCA蛋白質定量試劑盒（UE285903）購自Thermo Fisher Scientific公司；兔抗大鼠MT-ND1（GR3189552-7）、MT-ND3（GR3202807-11）、MT-ND5（GR3286204-5）購自Abcam公司；兔抗大鼠MT-ND2（AB2E05N）、MT-ND4（AB2E06N）抗體購自Invitrogen公司；兔抗大鼠MT-ND6（A3918）抗體和兔抗大鼠FPR1（W0838）抗體均購自biorbyt公司；ECL化學發光液（No.1722102）購自Millipore公司；辣根酶標記山羊抗兔IgG（H+L，127760）、兔SP試劑盒（2005E1124）、DAB顯色試劑盒（2040A1012）和抗體稀釋液（19082903）購自北京中杉金橋公司。Tanon-5200化學發光分析儀和PowerPac Basic、Mini-PRO TEAN?Tetra、Mini Trans-Blot垂直電泳系統均購自Bio-Rad公司；CX41微圖HTC1600正置顯微鏡購自日本Olympus公司。

1.2 實驗動物 6周齡SPF級雄性SD大鼠30只，體質量180~200 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號：SCXK（京）2020-0004。正常飼料喂養，自由進食飼料和水，室內通風良好，飼養環境12 h光照與12 h黑暗交替循環，溫度（22±3）℃，相對濕度（50±10）%。大鼠適應性喂養1周后進行實驗。

1.3 分組與模型制備 將30只大鼠按隨機數字表法分為3組：假手術組、SAP模型3 h組和SAP模型6 h組，每組10只。假手術組僅在開腹并輕輕翻動胰腺后關閉腹腔。參照文獻［8］方法，模型制備前禁食12 h，不禁水。以10%水合氯醛（0.3 g/kg）腹腔注射麻醉，無菌條件下經腹壁正中切口入腹，于膽管出肝門端以無損傷小動脈夾暫時阻斷膽管，尋找到膽胰管十二指腸乳頭開口處，在其對應系膜緣處用4號注射針頭刺一小孔，用PE50導管經乳頭部逆行插入膽胰管0.5 cm，妥善固定，以5%?；悄懰徕c勻速注入（50 mg/kg，0.1 mL/min），注射完畢后拔管，5 min后去除小動脈夾，以無損傷縫線縫合十二指腸穿刺孔，縫合腹壁。實驗完畢后將各組大鼠放回鼠籠常規飼養，密切關注其生命體征。

1.4 樣本采集 SAP造模3 h后對SAP模型3 h組取材，SAP造模6 h后對假手術組和SAP模型6 h組取材。以10%水合氯醛（0.3 g/kg）腹腔注射麻醉，大鼠取仰臥位固定開腹，4%枸櫞酸鈉（1∶9）預潤洗處理一次性無菌注射器，抽取腹主動脈全血5 mL，將抗凝全血離心留取血漿，分裝儲存于-20℃備用；取胰腺組織于4%多聚甲醛中固定備用。

1.5 胰腺組織HE染色及病理評分 胰腺組織于4%多聚甲醛中固定48 h后取出，常規脫水包埋，行5μm厚切片，撈片后60℃烤片過夜，二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，蘇木素染色，流水沖洗片刻后伊紅染色，流水沖洗多余染料，脫水透明，中性樹膠封片，在顯微鏡下觀察胰腺組織形態學變化。依照Schmidt病理評分標準［9］對各組胰腺組織進行評分。

1.6 免疫組化法檢測胰腺組織FPR1表達 胰腺組織石蠟切片60℃烘片過夜后置于室溫30 min。切片置于新鮮二甲苯脫蠟及梯度乙醇脫水后，進行常規抗原熱修復，自然冷卻至室溫后用PBS漂洗3次，每次5 min，隨后置于濕盒內滴加內源性過氧化物酶阻斷劑室溫孵育15 min。經PBS漂洗3次，每次3 min，使用羊血清工作液于濕盒中封閉2 h，FPR1抗體（1∶200）4℃孵育過夜。次日復溫至室溫后PBS漂洗3次，每次3 min，生物素標記羊抗兔IgG濕盒常溫孵育15 min。PBS漂洗3次，每次3 min，用辣根酶標記鏈霉卵白素工作液于濕盒中常溫孵育15 min。PBS漂洗3次，每次3 min，滴加DAB顯色液顯色2~3 min，自來水中止顯色。蘇木素復染、脫水、透明，中性樹膠封片，鏡下觀察表達情況。采用Image J軟件測量典型圖像中陽性信號區域占比3次，FPR1陽性表達率（%）=強陽性占比+陽性占比+弱陽性占比。

1.7 免疫印跡法檢測血漿中6種線粒體NFPs表達 按照蛋白提取試劑盒說明書指示提取凍存血漿蛋白，BCA蛋白質定量試劑盒進行蛋白定量，用loading buffer配平蛋白提取液并在100℃金屬浴中加熱10 min。根據蛋白不同情況取最佳上樣量，其中MT-ND1、MT-ND3和MT-ND6上樣量均為60μg，MT-ND2和MT-ND4上樣量均為30μg，MT-ND5上樣量為10μg。SDS-PAGE分離，轉膜，室溫下用5%脫脂牛奶封閉，4℃孵育兔抗大鼠一抗MT-ND1（1∶1 000）、MT-ND2（1∶500）、MT-ND3（1∶1 000）、MT-ND4（1∶1 000）、MT-ND5（1∶500）、MT-ND6（1∶1 000）過夜，洗膜，室溫下孵育羊抗兔二抗（1∶5 000）1 h，洗膜，加入ECL發光液于化學發光分析儀中曝光。用Image J軟件重復測量各條帶灰度值3次。各組MTND1水平為各組MT-ND1蛋白灰度值與假手術組MT-ND1蛋白灰度值均值的比值，MT-ND2、MT-ND3、MT-ND4、MTND5和MT-ND6依此類推。

1.8 統計學方法 采用SPSS 22.0進行數據分析，正態分布的計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t法。胰腺組織FPR1陽性表達率數據通過取平方根變換后滿足正態性和方差齊性。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

Fig.1 HE staining of the pancreatic tissues(first row×100;second row×200)圖1 各組胰腺組織的HE染色情況（第一排×100；第二排×200）

2.1 各組胰腺組織HE染色以及病理評分結果 假手術組胰腺組織無水腫、充血和胰腺壞死，鏡下無明顯病理變化，胰腺腺泡排列規則，腺管形態正常，無明顯充血、壞死和炎性浸潤，且胰島結構完整。與假手術組比較，SAP模型3 h組和SAP模型6 h組的胰腺組織病變明顯，表現為胰腺組織出血，腺泡細胞明顯腫脹、壞死，小葉結構紊亂，葉間隙增寬，間質內有明顯炎性細胞浸潤等病理改變。其中SAP模型6 h組可見腺泡細胞壞死更甚，中性粒細胞、單核細胞等炎性細胞浸潤面積更大，出血更加明顯，胰島周圍尤甚，見圖1。假手術組、SAP模型3 h組和SAP模型6 h組病理評分分別為（4.20±1.64）、（9.40±1.39）和（13.50±1.41）分，差異有統計學意義（F=98.576，P＜0.05）。與假手術組比較，SAP模型3 h組和SAP模型6 h組的病理評分明顯升高，SAP模型6 h組病理評分明顯高于SAP模型3 h組（均P＜0.05）。

2.2 各組胰腺組織FPR1表達水平 假手術組中胰腺腺泡細胞未見明顯FPR1表達，僅胰島出現弱陽性表達；相較于假手術組，SAP模型3 h組和SAP模型6 h組的胰腺組織FPR1主要定位表達于炎性浸潤區域和胰腺組織壞死區域，且SAP模型6 h組因壞死區域面積更大，炎性細胞浸潤更甚，而出現明顯黃棕染色情況，見圖2。假手術組、SAP模型3 h組和SAP模型6 h組的FPR1陽性表達率分別為（11.00±1.34）%、（31.80±2.12）%和（56.90±1.37）%，差異有統計學意義（F=4 636.458，P＜0.05），SAP模型3 h組和SAP模型6 h組的胰腺組織FPR1表達水平均較假手術組升高，SAP模型6 h組的FPR1陽性表達率較SAP模型3 h組明顯增加（P＜0.05）。

Fig.2 Expression of FPR1 in pancreatic tissue(IHC,first row×100;second row×200)圖2 胰腺組織中FPR1的表達（免疫組化法，第一排×100；第二排×200）

2.3 血漿中6種線粒體NFPs的表達水平 與假手術組相比，SAP模型3 h組和SAP模型6 h組的MTND1、MT-ND3和MT-ND6蛋白表達水平均顯著增高（P＜0.05），且呈現遞增趨勢。SAP模型3 h組和SAP模型6 h組MT-ND2表達水平相較于假手術組表達均升高，但SAP模型6 h組表達低于SAP模型3 h組（P＜0.05）。MT-ND4表達水平在3組中呈現遞減趨勢（P＜0.05）。3組MT-ND5表達水平差異無統計學意義。見圖3、表1。

Fig.3 Expression levels of 6 kinds of mitochondrial N-formyl peptides in plasma圖3 血漿中6種線粒體NFPs的表達

Tab.1 Comparison of expression levels of 6 mitochondrial NFPs in plasma of rats between the three groups表1 各組大鼠血漿中6種線粒體NFPs的表達比較（n=10，±s）

Tab.1 Comparison of expression levels of 6 mitochondrial NFPs in plasma of rats between the three groups表1 各組大鼠血漿中6種線粒體NFPs的表達比較（n=10，±s）

＊P＜0.05；a與假手術組相比，b與SAP模型3 h組相比，P＜0.05。

組別假手術組SAP模型3 h組SAP模型6 h組F MT-ND1 1.05±0.39 11.38±6.04a 18.54±6.83ab 20.040＊MT-ND2 0.82±0.16 1.93±0.20a 1.52±0.44ab 22.233＊MT-ND3 0.80±0.25 1.93±0.86a 4.87±0.63ab 100.387＊組別假手術組SAP模型3 h組SAP模型6 h組F MT-ND4 1.00±0.26 0.75±0.28a 0.40±0.10ab 18.126＊MT-ND5 1.00±0.17 1.01±0.07 1.12±0.20 1.249 MT-ND6 0.80±0.18 1.38±0.41a 4.38±0.40ab 291.374＊

3 討論

早期SAP患者死亡的重要原因是伴有全身炎癥反應綜合征（SIRS）的暴發性器官衰竭［10］。在急性創傷過程中，NFPs釋放到外周循環系統，和對線粒體DAMPs有反應的免疫細胞一起參與SIRS的形成［11］。已知NFPs的公認經典配體FPRs［12］所介導的疾病包括炎癥性肺部疾?。?3］、結腸炎、單核苷酸多態性相關牙周炎等［14］。FPR1在眾多免疫細胞均有表達，且作為體內炎癥環境的關鍵調節器已成為研究的熱點［15］。研究發現，經典的核苷酸結合寡聚化結構域樣受體3炎性體可通過FPR1通路調控閉塞性細支氣管炎綜合征［16］。早期AP出現的并發癥均與血管功能紊亂有關，包括內皮激活和損傷，血管通透性增加，白細胞向組織遷移增加等［17］；而FPR1的激活可以刺激眾多下游信號通路，這些信號通路與血管收縮和中性粒細胞的黏附、趨化、吞噬、分泌顆粒的胞吐等作用有關［18］。通過調控中性粒細胞的功能，FPR1在炎癥和許多疾病的病理過程中均扮演重要角色［19-20］。但是，炎癥反應為自身免疫的重要一環，其作用對人體是“有利”還是“有害”，取決于FPR1所介導的炎癥反應的方向與程度。FPRs本身還可作為藥物作用靶點，用于許多炎癥性疾病的針對性治療［21］，如競爭性FPR1拮抗劑二肽HCH6-1可能作為一種治療FPR1相關炎癥性肺部疾病的新藥物［22］。

本研究顯示，?；悄懰徕c誘導大鼠SAP模型后胰腺組織出現明顯出血壞死以及炎性浸潤。隨著SAP造模時間延長，胰腺組織FPR1表達逐漸增加，表明SAP大鼠胰腺病變程度與FPR1相關；而FPR1與炎癥密不可分，推測其與SAP的過度炎癥反應和炎癥級聯放大有關。值得注意的是，Gabl等［23］發現MT-ND3和MT-ND6對FPR1有受體偏好，MT-ND4和MT-ND5傾向于FPR2，MT-ND2是較弱的中性粒細胞激活劑，MT-ND1不發揮激動或拮抗FPR作用。本研究發現，MT-ND5的表達與SAP病情無明顯關系，MT-ND1、MT-ND3和MT-ND6隨病情進展而表達升高，推測其可能參與SAP的炎癥反應過程，且其表達水平與炎癥程度有關。3組MT-ND2的表達結果則呈“類鐘形”曲線，可能表明其確實參與炎癥反應，但受到其他調控或蛋白的影響。隨著SAP造模時間延長，MT-ND4可能出現了負反饋式表達遞減，具體調節機制有待進一步探究。

綜上所述，SAP進程中，包括胰腺腺泡細胞在內的受損細胞會釋放線粒體NFPs進入血循環，激活FPR信號通路，而趨化受體FPR1的活化將進一步激活包括中性粒細胞在內的免疫細胞，這與?；悄懰徕c誘導的SAP失控的過度炎癥反應密切相關。本研究為線粒體NFPs在內的DAMPs參與SAP病程提供了理論基礎，具體機制有待進一步研究論證。