鐵死亡在神經系統疾病中作用的研究進展

張晉毓，田首元，郭志佳，姚 豆，李 貝

1 鐵死亡概述

鐵死亡是Dixon等[1]在2012年首次提出的一種以細胞內鐵積累為特征的細胞死亡形式。主要表現為細胞膜不飽和脂肪酸消耗和細胞內鐵離子積累誘導的脂質活性氧(ROS)[2-3]的積累。其相關機制是在二價鐵或脂氧合酶的作用下，催化細胞膜上高度表達的不飽和脂肪酸發生脂質過氧化，從而導致細胞膜不飽和脂肪酸消耗[2]；此外還表現在抗氧化體系，谷胱甘肽(GSH)和谷胱甘肽過氧化物酶4(GPX4)的表達量降低，導致ROS的過度積累引起細胞中氧化應激反應的發生，使蛋白質、核酸和脂質發生不可修復的損傷，最終導致細胞死亡[4]。這種死亡方式與細胞凋亡、壞死和自噬無論在形態、生物化學及遺傳上均不相同[1]。在形態學上，電子顯微鏡下觀察到鐵死亡細胞出現線粒體萎縮，而其他細胞死亡形式線粒體通常表現為膨脹[1]。Dixon等[1]首先確定了一組特定的調控鐵死亡的基因，包括核糖體蛋白L8(RPL8)、鐵反應元件結合蛋白2(IREB2)和ATP合酶F0復合物亞基C3(ATP5G3)。后來的研究表明，許多基因/蛋白參與了這一獨特的細胞死亡過程，包括環氧合酶-2(PTGS2)[5]、p53[6]、核因子e2相關因子2(Nrf2)[7]、磷脂酰乙醇胺結合蛋白1(PEBP1)抗體[8]等。除了這些關鍵的調節因子外，過量的谷氨酸、細胞內鐵離子的積累或小分子處理(如erastin、RSL3等)也可以導致鐵死亡的發生。同時，鐵死亡誘導劑和抑制劑也從另一個方面證明了鐵死亡發生的可能機制，鐵死亡誘導劑erastin(抑制谷氨酸/胱氨酸的抗轉運體system xc-)和直接抑制GPX4(RSL3)同樣可以誘導鐵死亡的發生[9-10]，說明鐵死亡與谷氨酸代謝有關。與此同時，Stockwell實驗組發現親脂性的抗氧化劑(α生育酚、丁羥甲苯和β-胡蘿卜素)可以抑制細胞鐵死亡的發生，但不能抑制細胞凋亡和壞死的發生，表明脂氧合酶和親脂性的ROS參與細胞鐵死亡過程[11-13]。所以，鐵死亡的發生與脂質代謝、氨基酸代謝、相關基因的表達和鐵離子的累計等均有關系[14]。

目前的鐵死亡誘導劑可分為3類：system xc-抑制劑(谷氨酸、伊拉斯汀、磺胺嘧啶和索拉非尼)、GSH消耗劑(buthioninesulfoximine和acetaminophen)和GPX4直接抑制劑(RSL3和FIN56)[1，13，15]。此外，一些小分子也被證實是鐵死亡抑制劑，包括可抑制脂質ROS(ferrostatin-1，Fer-1)[1]、去鐵胺(鐵離子螯合劑，DFO)、5-脂氧合酶抑制劑(齊留通，zileuton)[16]和鐵氧化劑(FINO2)[17]。鐵死亡誘導劑已被證實具有靶向殺死癌細胞的作用[18]。Jiang等[6]的研究報道鐵死亡有助于胚胎發育，p53在鐵死亡的調控中發揮重要作用。另外，在研究海馬切片的實驗中發現，鐵死亡促進了神經元的死亡[1]。實驗研究也發現，鐵死亡與多種神經退行性疾病有著密切的聯系[19-22]。

2 鐵死亡在神經系統疾病中的研究

2.1 腦卒中 當頸內動脈、大腦中動脈或椎/基底動脈閉塞而導致大腦某些特定部位的血液供應受限時，就會導致缺血性腦卒中的發生[23]。由缺血導致的氧氣和營養物質的供應減少可能激活缺血級聯反應的發生，從而導致氧化應激、線粒體損傷，并最終引起細胞死亡[24]。研究已經發現，在缺血性腦卒中的動物模型中，在發現鐵死亡之前，鐵離子的積累會加劇缺血再灌注過程中神經元的損傷[25-31]。研究表明，鐵螯合劑可以減少動物的缺血再灌注損傷[32-35]。Speer等[36]研究推測，鐵死亡可能導致腦缺血再灌注后的神經元死亡。在神經缺氧條件下，缺氧誘導因子(HIF)的表達可以減輕神經細胞損傷，從而調控缺氧條件下的微環境，而缺氧誘導因子-1脯氨酸羥化酶(hypoxia-inducible factor-1 prolyl hydroxylases，HIF-1PDH)具有分解HIF的作用，通過減少HIF從而加重神經細胞損傷。缺氧誘導因子脯氨酸羥化酶(HIF-PDH)的抑制劑被證實有神經保護作用，可作為金屬螯合劑的有效靶點。Speer等[36]進一步假設，鐵螯合劑對防止鐵死亡是由于抑制了酮戊二酸、氧依賴性雙加氧酶和HIF-PDH，而不是通過直接抑制Fenton反應或ROS的形成防止鐵死亡的發生。隨后，2017年的一項研究表明，在大腦中動脈閉塞模型(MCAO)中，鐵死亡抑制劑對小鼠缺血-再灌注損傷具有保護作用，提示鐵死亡可導致缺血性腦卒中后神經元死亡[37]。進一步研究發現，敲除tau蛋白的小鼠在缺血-再灌注損傷后鐵死亡導致的細胞死亡減輕，表明Tau蛋白可能參與調節缺血再灌注損傷誘導的鐵死亡機制[37]。腦出血占所有腦卒中病例的10%～30%，其死亡率和發病率較缺血性腦卒中高[38-39]。目前，細胞凋亡、壞死和自噬被認為是導致腦出血后神經元死亡的唯一因素[40-45]。但是，在腦出血的離體實驗和在體實驗中均存在神經元鐵死亡的發生[46-48]。2014年，相關研究發現，表兒茶素(epicatechin)是一種可滲透腦的黃烷醇，可以減少腦出血后早期腦損傷，部分原因是通過減少腦內鐵沉積和鐵死亡相關基因表達[20]。2017年，在腦切片培養中發現，Fer-1可減少血紅蛋白誘導的神經元死亡，使GPX4活性降低，挽救發生鐵死亡的神經元，降低膠原酶和血液注射誘導的腦出血小鼠模型中環氧合酶-2(COX-2)的表達[19]。此外，通過透射電子顯微鏡發現體內鐵死亡與壞死和自噬共存，使用聯合抑制劑治療這些不同形式的細胞死亡，比單獨使用任何抑制劑能更好地抑制由血紅蛋白誘導的神經元死亡的發生[19，48]。在體外實驗中，Fer-1、DFON-acetylcysteine(可抑制活性氧和活性脂質)和Trolox(一種靶向反應脂類的維生素E類似物)等鐵死亡抑制劑，能夠逆轉由血凝素和血紅蛋白誘導的小鼠皮層神經元的死亡，且高水平phospho-ERK1/2與神經元鐵死亡的增多有關，而MEK抑制劑U0126抑制了這種細胞死亡機制[47]。但是，在erastin誘導的發生鐵死亡的癌細胞中，選擇性更強、更有效的MEK抑制劑PD0325901未能阻止細胞死亡的發生，可能與U0126具有脫靶效應，MEK-ERK1/2信號通路不參與鐵死亡等機制有關[49]。壞死抑制劑necrostatin-1也可以降低血紅素誘導的細胞死亡，并且在體外實驗中這些抑制劑的細胞表現出壞死表型、細胞膜完整性喪失、細胞器崩解，提示鐵死亡可能是壞死的早期階段[47]。Zhang等[50]研究表明，在腦出血急性期，GPX4表達水平明顯降低，可通過升高GPX4水平減少神經元細胞鐵死亡的發生，改善腦出血大鼠預后。

2.2 帕金森病(PD) PD是一種典型的黑質病變(SNpc)的神經系統疾病，而黑質部主要調節運動功能，故PD可引起強直、震顫和其他一系列運動癥狀[51-52]。在PD的進展過程中，細胞凋亡是導致細胞死亡的主要因素[53]。研究表明，在PD病人中，SNpc中的鐵和多巴胺水平升高[54-56]。值得注意的是，PD病人常見的GSH缺失、脂質過氧化和ROS水平升高也是鐵蛋白增多的特征[57-59]。Ayton等[60]的研究也顯示，缺失銅藍蛋白(一種鐵離子轉運酶)基因的小鼠會出現PD，而鐵螯合劑可以避免PD的發生。此外，鐵螯合劑已經被證明可以改善動物模型[56，60-61]和臨床試驗[62]中PD的運動癥狀。

鐵死亡與PD的發生有關[21]。研究者發現，鐵死亡是多巴胺能神經元細胞死亡的一個關鍵通路，erastin誘導的LUHMES細胞(多巴胺能神經元前體細胞)中鐵死亡是由MEK以不依賴ras的方式激活引起的[21]。這一機制與其他細胞系的研究結果不同，在其他細胞系中，鈣螯合劑BAPTA和PKC抑制劑(雙吲哚馬來酰亞胺模擬物Bis-Ⅲ和siRNA)對阻止erastin誘導的細胞死亡非常有效，研究者認為這種死亡機制是多巴胺能神經元的一種獨特的代謝特征[21，63]。Gouel等[64]發現，人血小板裂解物具有保護LUHMES細胞的作用，使其免受erastin誘導的鐵死亡的發生。在erastin處理的LUHMES細胞中，可能由于MEK抑制劑U0126的脫靶效應導致了這些爭議結果的產生[21，64]。實驗研究發現，星形膠質細胞主要是通過為神經元提供GSH和其他抗氧化劑，保護神經元免受氧化損傷[65]。因此，星形膠質細胞與神經元相互作用的失調也可能導致多巴胺能神經元鐵死亡的發生[66-67]。

2.3 阿爾茨海默病(AD) AD是一種病因不明的神經退行性病變[68]。對AD病人大腦的尸檢分析顯示其神經元有凋亡的跡象[69-70]，但目前研究認為，鐵死亡促進了AD神經元的破壞，因為其中一些退化過程不能單獨用細胞凋亡來解釋，而且針對治療細胞凋亡的藥物大多無效[71-72]。在AD病人大腦中已發現脂質過氧化和鐵離子調節異常，而這是鐵死亡的主要特征[73-74]。研究發現，敲除特異性大腦皮質和海馬神經元GPX4基因的小鼠出現了海馬神經元的變性，并且在水迷宮測試中表現出明顯的認知功能障礙，退化的神經元可能正在發生鐵死亡，因為當小鼠被給予鐵死亡抑制劑liproxstatin-1時，神經退行性變的程度明顯改善[75-76]。另一項研究表明，Tau蛋白的過度表達和過度磷酸化導致了AD病人神經元鐵死亡的發生，而α-硫辛酸通過下調轉鐵蛋白受體、降低phospho-P38水平、上調xCT和GPX4表達可降低AD病人神經元鐵死亡的發生[77]。這些研究均表明，鐵死亡對學習和記憶有關的神經元具有重大的影響作用，同時也表明鐵死亡在AD的發生發展中起重要作用。

2.4 亨廷頓舞蹈病(HD) HD是另一種進展性神經退行性疾病，主要癥狀是癡呆和不自主運動。在實驗HD動物模型和HD病人中利于發現有氧化損傷[78]、脂質過氧化[79]、鐵積累[80]、GSH失調[81]和GPX活性降低[82]。鐵螯合劑已被證明可以改善HD小鼠的認知功能[80]。一項使用HD細胞模型來檢測鐵死亡抑制劑Fer-1是否可以抑制細胞死亡的研究發生，結果表明，在HD進展過程中可能存在鐵死亡的發生[22]。目前，仍需要在體實驗研究來驗證鐵死亡是否在HD的進展中發揮其特異的病理機制。

2.5 腦室周圍白質軟化癥(PVL) PVL是一種常見于早產兒的腦白質損傷，其特征是發育中的少突膠質細胞死亡[83]。多項研究表明，鐵死亡在其中發揮重要作用。研究發現，死亡細胞的ROS生物標志物水平升高[84-86]。此外，在白質損傷嬰兒的腦脊液中發現富含典型的鐵死亡的脂質氧化產物[85]。另一項研究發現，大鼠少突膠質細胞GSH缺失可導致細胞死亡，而維生素E(已知的鐵死亡抑制劑)可預防這種死亡的發生[87]。為了在體外模擬PVL， Skouta等[22]在無胱氨酸的培養基中培養少角膠質細胞，使其消耗GSH并導致細胞死亡，結果顯示，Fer -1和SRS11-92(比Fer-1效能強15倍)完全保護少突膠質細胞不受GSH缺失的影響。

3 小 結

鐵死亡是一種細胞死亡形式，與氨基酸、脂質和鐵代謝均有關。目前，鐵死亡的研究主要在神經系統疾病，在其他系統疾病的研究較少。鐵死亡的研究剛剛起步，尚有很多問題有待進一步研究，例如有哪些基因參加了鐵死亡的發生，鐵蛋白和轉鐵蛋白相關基因的表達是否與鐵死亡的發生有關；檢測鐵死亡的指標除了電鏡、蛋白免疫印跡法(Western Blot)之外是否還有更精確的檢查標準；細胞內具體存在哪些調控鐵死亡的通路；是否還會導致其他神經系統疾病的發生等。鐵死亡的發現為一些疾病的發生機制做出了合理的解釋，也為相應疾病的治療提供了新的靶點和思路。