凍融胚胎過(guò)夜培養(yǎng)后生長(zhǎng)融合狀況對(duì)妊娠結(jié)局的影響

路新樂(lè)，黃鮮菊，史昊，韓瀟，畢鋇鋇，崔秋盈，胡琳莉

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，鄭州 450052)

自1983年世界上第1例凍融胚胎成功妊娠以來(lái)，凍融胚胎移植(FET)在人類輔助生殖領(lǐng)域中的應(yīng)用越來(lái)越廣泛[1]。FET不僅在減少促排卵次數(shù)、增加胚胎利用率、減輕患者經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)等方面發(fā)揮出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，而且其對(duì)于因卵巢過(guò)度刺激綜合征(OHSS)等因素不適合行新鮮周期移植的患者來(lái)說(shuō)，是一種重要的治療方案[2-3]。研究顯示患者年齡、胚胎質(zhì)量、移植日子宮內(nèi)膜厚度、移植胚胎數(shù)等均為影響FET妊娠結(jié)局的因素，其中胚胎質(zhì)量是決定是否成功妊娠的重要因素之一[4]。有研究認(rèn)為，凍融胚胎經(jīng)過(guò)夜培養(yǎng)后有絲分裂的恢復(fù)可作為評(píng)價(jià)胚胎質(zhì)量的指標(biāo)之一，有助于篩選出具有高發(fā)育潛能的胚胎[5-6]。本研究通過(guò)回顧性分析復(fù)蘇胚胎過(guò)夜培養(yǎng)18～20 h后卵裂球的生長(zhǎng)融合狀況，探討其對(duì)FET 妊娠結(jié)局的影響，以期為臨床工作提供更好的指導(dǎo)。

資料與方法

一、研究對(duì)象

選擇2019年1月至2020年4月在鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖中心接受FET助孕治療的2 064例患者為研究對(duì)象，共2 064個(gè)FET周期。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡≤45歲；移植日內(nèi)膜厚度≥7 mm；女方不孕因素包括排卵障礙、盆腔輸卵管因素、免疫因素或不明原因不孕，男方不育因素包括少、弱、畸精子癥或無(wú)精子癥等；(2)胚胎冷凍方式均為玻璃化冷凍，所有解凍復(fù)蘇移植的胚胎均為受精后72 h的第3天(D3)Ⅰ、Ⅱ級(jí)優(yōu)質(zhì)卵裂期胚胎；(3)解凍后培養(yǎng)時(shí)間為18～20 h。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡>45歲；(2)女方存在子宮內(nèi)膜異位癥、宮腔粘連等影響著床的因素；(3)卵裂期和囊胚期胚胎混合移植的患者。

二、研究方法

1.分組：根據(jù)移植胚胎數(shù)目不同分為移植1枚胚胎組(單胚組)和移植兩枚胚胎組(雙胚組)；根據(jù)過(guò)夜培養(yǎng)后胚胎是否分裂生長(zhǎng)將單胚組分為單胚生長(zhǎng)組(601個(gè)周期)和單胚無(wú)生長(zhǎng)組(185個(gè)周期)，將雙胚組分為雙胚生長(zhǎng)組(1 175個(gè)周期)和雙胚無(wú)生長(zhǎng)組(103個(gè)周期)。再根據(jù)胚胎是否有融合將單胚生長(zhǎng)組和雙胚生長(zhǎng)組分別分為兩個(gè)亞組：?jiǎn)闻呱L(zhǎng)融合組(395個(gè)周期)和單胚生長(zhǎng)無(wú)融合組(206個(gè)周期)，雙胚生長(zhǎng)融合組(889個(gè)周期)和雙胚生長(zhǎng)無(wú)融合組(286個(gè)周期)。

2.胚胎質(zhì)量評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：本中心采用Peter評(píng)分系統(tǒng)[7]進(jìn)行D3胚胎評(píng)分：Ⅰ級(jí)胚胎：卵裂球形態(tài)均勻且規(guī)則，呈球形，透明帶完整，折光適度，無(wú)碎片或碎片含量<10%；Ⅱ級(jí)胚胎：卵裂球略不均勻規(guī)則，輕度折光，碎片含量>10%而<30%；Ⅲ級(jí)胚胎：卵裂球略不均勻規(guī)則，輕度折光，碎片含量>30%而<50%。考慮到移植胚胎質(zhì)量會(huì)對(duì)妊娠結(jié)局產(chǎn)生重要的影響，故本研究納入的冷凍卵裂期胚胎均為Ⅰ級(jí)、Ⅱ級(jí)優(yōu)質(zhì)胚胎。

3.胚胎冷凍：使用Kitazato試劑盒(加藤，日本)進(jìn)行玻璃化冷凍，冷凍液分為ES液和VS液，分別置于4℃冰箱保存。使用前將冷凍液在室溫(25℃)下平衡至少30 min。隨后將胚胎吸入ES液，室溫下放置約8 min。當(dāng)胚胎卵裂球由圓形到皺縮再擴(kuò)張至原體積時(shí)，將胚胎從ES液移入VS液中，隨后將胚胎放置于無(wú)菌載桿上，并迅速投入液氮中(時(shí)間<1 min)。

4.胚胎復(fù)蘇及復(fù)蘇后的觀察：胚胎復(fù)蘇于移植前1日的下午進(jìn)行。采用Kitazato試劑盒(加藤，日本)進(jìn)行，將4種解凍液(解凍液1、解凍液2、解凍液3和解凍液4)分別置于4℃冰箱冷藏保存。胚胎復(fù)蘇前，將解凍液1在37℃培養(yǎng)箱內(nèi)平衡1 h以上，解凍液2、3、4分別在室溫(25℃)下平衡30 min以上。隨后將冷凍載桿從液氮中取出，迅速將冷凍栽桿前端裝有胚胎的部分浸入解凍液1中，使胚胎脫落其中(時(shí)間約1 min)，再將胚胎依次移入解凍液2、3和4中，分別放置3 min、5 min、5 min，隨后轉(zhuǎn)入預(yù)先平衡好的培養(yǎng)液中過(guò)夜培養(yǎng)(18～20 h)后移植。

本中心用于冷凍移植的胚胎均為正常受精發(fā)育而來(lái)的胚胎。過(guò)夜培養(yǎng)18～20 h后觀察并記錄胚胎的生長(zhǎng)發(fā)育情況，培養(yǎng)后胚胎卵裂球數(shù)目大于解凍后卵裂球數(shù)目時(shí)，稱為胚胎生長(zhǎng)；培養(yǎng)后胚胎卵裂球數(shù)目未增加，稱為胚胎未生長(zhǎng)。胚胎卵裂球形成致密連接，細(xì)胞邊界不明顯時(shí)稱為胚胎卵裂球融合；胚胎卵裂球數(shù)目增加但未形成致密連接，細(xì)胞邊界較明顯時(shí)稱為胚胎卵裂球未融合。

5.內(nèi)膜準(zhǔn)備及FET：內(nèi)膜準(zhǔn)備方案分為自然周期和人工周期方案兩種。平素月經(jīng)周期規(guī)律、排卵正常的患者可以采用自然周期方案：于月經(jīng)周期的第10天左右開始監(jiān)測(cè)患者卵泡發(fā)育和子宮內(nèi)膜情況，當(dāng)優(yōu)勢(shì)卵泡直徑>14 mm時(shí)，監(jiān)測(cè)血清中雌二醇(E2)、黃體生成素(LH)、孕酮(P)以及尿中LH水平，于LH峰的次日或B超監(jiān)測(cè)排卵日開始肌肉注射黃體酮針劑(浙江仙琚)40 mg/d，第3天下午解凍胚胎，過(guò)夜培養(yǎng)后第4天上午移植。移植后陰道給藥黃體酮凝膠(雪諾同，默克雪蘭諾，德國(guó))200 mg/d，同時(shí)口服地屈孕酮(達(dá)芙通，雅培，荷蘭)10 mg/次，2次/d，進(jìn)行黃體支持。對(duì)于月經(jīng)不規(guī)律、排卵障礙的患者采用人工周期方案：在月經(jīng)第3～5天開始口服戊酸雌二醇(補(bǔ)佳樂(lè)，拜爾，德國(guó))2～4 mg/d，根據(jù)超聲監(jiān)測(cè)的子宮內(nèi)膜厚度適時(shí)調(diào)整用藥劑量，當(dāng)子宮內(nèi)膜≥8 mm時(shí)，增加黃體酮針劑60 mg/d肌肉注射，于黃體酮注射第4天行胚胎移植，移植次日開始黃體支持，具體方案同自然周期。

6.主要觀察指標(biāo)及妊娠結(jié)局判斷標(biāo)準(zhǔn)：主要觀察指標(biāo)為臨床妊娠率、流產(chǎn)率、異位妊娠率、多胎率及活產(chǎn)率。臨床妊娠率=臨床妊娠周期數(shù)/總移植周期數(shù)×100%；流產(chǎn)率=流產(chǎn)周期數(shù)/臨床妊娠周期數(shù)×100%；異位妊娠率=異位妊娠周期數(shù)/臨床妊娠周期數(shù)×100%；多胎率=(≥2個(gè)孕囊的周期數(shù)/臨床妊娠周期數(shù))×100%；活產(chǎn)率=活產(chǎn)周期數(shù)/總移植周期數(shù)×100%。

移植后14 d通過(guò)檢測(cè)血清人絨毛膜促性腺激素(β-HCG)水平判斷是否生化妊娠，移植后28 d陰道超聲下可見孕囊者為臨床妊娠。繼續(xù)黃體支持至妊娠 10～12周，并隨訪至活產(chǎn)。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、患者的一般情況

共納入2 064個(gè)卵裂期FET周期，胚胎解凍后均過(guò)夜培養(yǎng)18～20 h后進(jìn)行移植。納入周期中，采用自然周期準(zhǔn)備內(nèi)膜的比例為42.6%，人工周期準(zhǔn)備內(nèi)膜比例為57.3%，不同方案比例比較無(wú)顯著性差異(P>0.05)。納入患者平均年齡(33.11±5.52)歲，平均不孕年限(5.21±3.52)年，平均體質(zhì)量指數(shù)(BMI)(23.32±2.92)kg/m2，平均子宮內(nèi)膜厚度(11.55±2.38)mm。

單胚組中單胚生長(zhǎng)組和單胚無(wú)生長(zhǎng)組患者年齡、BMI、基礎(chǔ)性激素水平及移植日子宮內(nèi)膜厚度比較均無(wú)顯著性差異(P>0.05)(表1)；雙胚組中雙胚生長(zhǎng)組和雙胚無(wú)生長(zhǎng)組比較，上述參數(shù)亦無(wú)顯著性差異(P>0.05)(表2)。

表1 單胚生長(zhǎng)組和單胚無(wú)生長(zhǎng)組患者基本情況比較

表2 雙胚生長(zhǎng)組和雙胚無(wú)生長(zhǎng)組患者基本情況比較

二、復(fù)蘇后胚胎是否恢復(fù)分裂生長(zhǎng)對(duì)妊娠結(jié)局的影響

單胚組共解凍920枚胚胎，復(fù)蘇884枚胚胎，復(fù)蘇率為96.09%，種植率為30.03%；單胚生長(zhǎng)組的臨床妊娠率(35.77% vs.16.76%)、活產(chǎn)率(26.96% vs.10.81%)均顯著高于單胚無(wú)生長(zhǎng)組(P<0.05)；兩組間流產(chǎn)率、異位妊娠率、多胎率比較無(wú)顯著性差異(P>0.05)(表3)。雙胚組共解凍2 578枚胚胎，復(fù)蘇率為98.64%，種植率為38.84%；雙胚生長(zhǎng)組的臨床妊娠率(61.45% vs.26.21%)、活產(chǎn)率(50.21% vs.19.42%)均顯著高于雙胚無(wú)生長(zhǎng)組(P<0.05)；兩組間流產(chǎn)率、異位妊娠率、多胎率比較無(wú)顯著性差異(P>0.05)(表4)。

表3 單胚生長(zhǎng)組和單胚無(wú)生長(zhǎng)組患者妊娠結(jié)局比較(%)

表4 雙胚生長(zhǎng)組和雙胚無(wú)生長(zhǎng)組患者妊娠結(jié)局比較(%)

三、卵裂球是否融合對(duì)妊娠結(jié)局的影響

單胚生長(zhǎng)融合組的臨床妊娠率(42.78% vs.22.33%)、活產(chǎn)率(32.41% vs.16.50%)均顯著高于單胚生長(zhǎng)無(wú)融合組(P<0.05)；兩組間流產(chǎn)率、異位妊娠率、多胎率比較無(wú)顯著性差異(P>0.05)(表5)。雙胚生長(zhǎng)融合組的臨床妊娠率(64.34% vs.52.45%)、多胎率(37.59% vs.22.67%)、活產(chǎn)率(52.98% vs.41.61%)均顯著高于雙胚生長(zhǎng)無(wú)融合組(P<0.05)；兩組間流產(chǎn)率、異位妊娠率比較無(wú)顯著性差異(P>0.05)(表6)。雙胚生長(zhǎng)融合組與單胚生長(zhǎng)融合組比較，臨床妊娠率(64.34% vs.42.78%)、多胎率(37.59% vs.1.78%)及活產(chǎn)率(52.98% vs.32.41%)均顯著升高，異位妊娠率顯著降低(2.27% vs.5.33%)(P<0.05)；兩組間流產(chǎn)率比較無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

表5 單胚生長(zhǎng)融合組和單胚生長(zhǎng)無(wú)融合組的妊娠結(jié)局比較(%)

表6 雙胚生長(zhǎng)融合組和雙胚生長(zhǎng)無(wú)融合組的妊娠結(jié)局比較(%)

四、Logistic回歸分析

將本項(xiàng)研究納入的參數(shù)，即年齡、BMI、基礎(chǔ)FSH、基礎(chǔ)LH、不孕年限、移植胚胎數(shù)、胚胎是否分裂生長(zhǎng)、胚胎是否融合、移植日內(nèi)膜厚度等進(jìn)行Logistic分析，結(jié)果顯示，胚胎分裂生長(zhǎng)[OR=2.599，95%CI(1.829，3.693)]、胚胎融合[OR=1.790，95%CI(1.436，2.231)]及移植胚胎數(shù)[OR=2.176，95%CI(1.774，2.671)]與臨床妊娠率呈正相關(guān)(P<0.05)。年齡與臨床妊娠率[OR=0.907，95%CI(0.890，0.925)]呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，與流產(chǎn)率[OR=1.134，95%CI(1.092，1.178)]呈正相關(guān)(P<0.05)。其它因素與臨床妊娠率、流產(chǎn)率無(wú)顯著相關(guān)性(P>0.05)，詳見表7、表8。

表7 臨床妊娠率影響因素的Logistic回歸分析

表8 流產(chǎn)率影響因素的Logistic回歸分析

討 論

近年來(lái)，隨著玻璃化冷凍技術(shù)的快速發(fā)展，F(xiàn)ET在輔助生殖技術(shù)(ART)中的應(yīng)用越來(lái)越廣泛[8]。在眾多影響FET妊娠結(jié)局的因素中，胚胎質(zhì)量是關(guān)鍵性的因素之一[9]。本研究納入胚胎均為卵裂期優(yōu)質(zhì)胚胎，以排除胚胎質(zhì)量對(duì)妊娠結(jié)局造成的影響。目前卵裂期凍融胚胎解凍后的培養(yǎng)法主要分為兩種，短時(shí)培養(yǎng)法和過(guò)夜培養(yǎng)法，后者的優(yōu)勢(shì)在于延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間后，可通過(guò)觀察胚胎卵裂球的分裂生長(zhǎng)狀況，從而選擇具有較好發(fā)育潛能的胚胎進(jìn)行移植[10-11]。同時(shí)，本研究中，大部分FET患者解凍胚胎數(shù)要多于移植胚胎數(shù)，通過(guò)過(guò)夜培養(yǎng)18～20 h后，相當(dāng)于對(duì)胚胎多了一次篩選，可以挑選到更高成活率的胚胎進(jìn)行移植，極大地提高了患者的臨床妊娠率。

Pavone等[12]的研究結(jié)果顯示提前解凍、延長(zhǎng)體外培養(yǎng)時(shí)間可以更好地觀察復(fù)蘇后胚胎是否繼續(xù)生長(zhǎng)，從而篩選出發(fā)育潛能較好的胚胎進(jìn)行移植，有利于提高臨床妊娠率并降低流產(chǎn)率。Joshi等[5]的研究也表明D3凍融胚胎過(guò)夜培養(yǎng)后恢復(fù)有絲分裂的胚胎可以獲得更高的臨床妊娠率。在本研究中，凍融胚胎解凍后經(jīng)過(guò)夜培養(yǎng)18～20 h，移植1枚胚胎的單胚組和移植兩枚胚胎的雙胚組的數(shù)據(jù)比較均顯示有生長(zhǎng)組的臨床妊娠率、活產(chǎn)率顯著高于無(wú)生長(zhǎng)組(P<0.05)，流產(chǎn)率均顯著低于無(wú)生長(zhǎng)組(P>0.05)，與上述報(bào)道[5]結(jié)果一致。李偉等[13-14]研究認(rèn)為過(guò)夜培養(yǎng)后胚胎發(fā)生融合，是移植成功的一個(gè)很好的預(yù)測(cè)指標(biāo)，發(fā)生融合的胚胎可以獲得更高的臨床妊娠率。本研究中，單胚組和雙胚組中，有融合組的臨床妊娠率、活產(chǎn)率均顯著高于無(wú)融合組(P<0.05)，提示復(fù)蘇胚胎經(jīng)過(guò)夜培養(yǎng)后，有絲分裂的恢復(fù)與妊娠結(jié)局息息相關(guān)，能夠恢復(fù)有絲分裂尤其是發(fā)生融合的胚胎，往往預(yù)示著更好的發(fā)育潛能。本研究中雙胚生長(zhǎng)融合組的臨床妊娠率、活產(chǎn)率顯著高于單胚生長(zhǎng)融合組，同時(shí)也導(dǎo)致多胎率的明顯升高，與耿旭景等[15]報(bào)道的結(jié)果一致，再次驗(yàn)證單胚胎移植明顯降低了多胎率，因此在臨床工作中，考慮到多胎妊娠對(duì)母親和胎兒的不良影響，對(duì)于過(guò)夜培養(yǎng)后恢復(fù)分裂生長(zhǎng)尤其達(dá)到融合狀態(tài)的胚胎，為了降低多胎率，推薦實(shí)行單胚胎移植。在實(shí)際的臨床工作中還可以考慮將胚胎培養(yǎng)至囊胚后行單囊胚移植，來(lái)降低多胎妊娠率等其他不良影響。

有研究認(rèn)為可能是由于過(guò)夜培養(yǎng)后恢復(fù)有絲分裂的胚胎打破了發(fā)育阻滯障礙，促進(jìn)了基因調(diào)控由母型調(diào)節(jié)向胚胎型調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)化，對(duì)后續(xù)胚胎的各種生長(zhǎng)與分化發(fā)揮了積極作用，可以獲得更好的臨床結(jié)局[16]。也有學(xué)者認(rèn)為冷凍胚胎提前解凍培養(yǎng)可能促進(jìn)了冷凍保護(hù)劑的充分代謝，使胚胎發(fā)育的速度相對(duì)更快一些[17]。同時(shí)過(guò)夜培養(yǎng)后發(fā)生融合的胚胎更接近人體自然生理狀態(tài)，確保了胚胎-子宮內(nèi)膜的同步化，更符合胚胎移植時(shí)機(jī)[18-19]。Laverge等[20]對(duì)過(guò)夜培養(yǎng)后未進(jìn)一步生長(zhǎng)的胚胎進(jìn)行原位熒光雜交實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示這類胚胎大部分表現(xiàn)為染色體異常，包括單倍體、三倍體、嵌合體等，僅20%左右的胚胎表現(xiàn)為正常的二倍體，因此認(rèn)為復(fù)蘇后未進(jìn)一步生長(zhǎng)的胚胎幾乎沒有利用價(jià)值。但本研究結(jié)果顯示，無(wú)生長(zhǎng)組的胚胎雖然臨床妊娠率和活產(chǎn)率略低，但其利用價(jià)值仍不容忽視。

本研究在控制其他混雜因素后，Logistic回歸分析結(jié)果顯示，胚胎是否分裂生長(zhǎng)、是否融合、年齡、移植胚胎數(shù)等與臨床妊娠率均有顯著相關(guān)性，同時(shí)年齡也與流產(chǎn)率有顯著相關(guān)性，其中，胚胎分裂生長(zhǎng)、融合及移植胚胎數(shù)與臨床妊娠率呈正相關(guān)(P<0.05)；年齡與臨床妊娠率呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，與流產(chǎn)率呈正相關(guān)(P<0.05)。研究顯示隨著年齡的增長(zhǎng)，女性卵巢的儲(chǔ)備功能、卵母細(xì)胞的質(zhì)量及子宮內(nèi)膜的容受性均逐漸下降，最終導(dǎo)致高齡婦女的移植結(jié)局相對(duì)較差[21]。

綜上所述，凍融胚胎過(guò)夜培養(yǎng)后的進(jìn)一步發(fā)育情況與妊娠結(jié)局相關(guān)，能夠恢復(fù)有絲分裂甚至發(fā)生融合的胚胎，預(yù)示著更好的妊娠結(jié)局。因此，延長(zhǎng)胚胎的體外培養(yǎng)時(shí)間可以更好地評(píng)估其發(fā)育潛能，對(duì)凍融周期胚胎的選擇有一定的指導(dǎo)意義。但是本研究尚有不足之處，首先，樣本量有待于進(jìn)一步擴(kuò)大；其次，本研究沒有考慮到治療方案、不孕類型、操作者等因素對(duì)FET妊娠結(jié)局的影響，且本研究中單胚胎移植的患者與雙胚胎移植的患者的自身基礎(chǔ)情況存在稍許差異，在后續(xù)研究中，需要擴(kuò)大樣本量和進(jìn)一步完善研究設(shè)計(jì)進(jìn)行更深入地探討。