精子DNA碎片指數對不同年齡女性體外受精-胚胎移植妊娠結局的影響

杜超，侯開波，張寧，關小川，劉星池，于月新

(中國人民解放軍北部戰區總醫院生殖醫學科，沈陽 110016)

近年來，不孕癥患者的數量逐年增加，根據WHO數據顯示，約15%有生育需求的夫婦受到不孕癥的困擾，其中男性因素約占不孕不育因素的50%[1]。過去很長一段時間內，人們對男性生殖力的評估仍然依賴于傳統的精液分析，但仍有約15%的不育男性精液常規結果為正常[2]，這說明單純分析精子數量和活力并不能全面評估男性生育力。隨著研究的深入，精子DNA碎片指數(DFI)逐漸受到關注，有研究認為，DFI對精子受精能力、胚胎形成和發育以及妊娠結局有著重要影響[3-4]；但也有研究認為DFI對于男性生育力評估和輔助生殖結局預測的價值有限[5-6]。因此，本研究在嚴格控制女方因素的影響后，用精子染色質結構分析(SCSA)法檢測精子DFI，觀察不同DFI患者的妊娠結局，探討精子DFI對體外受精-胚胎移植(IVF-ET)妊娠結局的影響。

一、資料與方法

1.研究對象及分組：收集2016年1月至2020年12月于北部戰區總醫院行IVF-ET治療的不孕不育夫婦為研究對象，共納入1 079個取卵周期(1 441個移植周期)。納入標準：(1)夫妻雙方染色體檢查均正常；(2)男方于助孕前3個月內行DFI檢查；(3)女方促排卵方案為長方案或改良長方案。排除標準：(1)男方存在嚴重的少精子癥；(2)女方存在子宮畸形、宮腔粘連、內膜過薄等不利胚胎著床因素；(3)女方存在嚴重的甲亢、甲減、糖尿病等內分泌疾病；(4)女方存在多囊卵巢綜合征(PCOS)或卵巢功能減退等；(5)未隨訪至最終妊娠結局者。

根據DFI值將患者分為3組：A組：DFI≤15%(精子DNA完整性好)，共845個周期；B組：15%

2.精子DFI檢測：DFI的有效檢測方法主要有SCSA、單細胞凝膠電泳(SCGE)試驗和精子染色質擴散(SCD)試驗等[7]。本研究采用敏感性和特異性良好，并且具有高度可比性的SCSA方法進行DFI檢測[8]。使用美國BD公司的流式細胞儀，檢測試劑盒為精子核完整性染色試劑盒(浙江星博生物)，嚴格按照產品說明書進行操作。

3.促排卵及IVF：促排卵方案采用標準長方案或改良長方案，期間超聲監測卵泡發育情況，待卵泡發育成熟后肌肉注射HCG(珠海麗珠)，36 h后B超引導下取卵。將男性精液采用上游法和密度梯度離心法進行優化處理后行IVF，受精16～18 h后觀察受精情況，常規胚胎培養。胚胎培養第3天(D3)觀察胚胎質量。D3胚胎評分標準參照卵裂期胚胎評分標準[9]：D2細胞數為2～4，D3細胞數為7～9，細胞大小相對均勻、形態相對規則、碎片<25%為優質胚胎。視胚胎發育情況決定是否行囊胚培養，囊胚評分參照Gardner評分[10]：滋養外胚層細胞及內細胞團評分均為A或B的囊胚為優質囊胚，有任一者評分為C的囊胚為非優質囊胚，兩者評分均為C的囊胚為不可利用囊胚。

4.胚胎移植及妊娠判斷：根據患者情況選擇新鮮胚胎移植或凍融胚胎移植，移植后行黃體支持。胚胎移植14 d后隨訪患者血HCG值，移植28 d后行超聲檢查，如宮腔內監測到孕囊及胎心，定義為臨床妊娠并記錄著床胚胎數，隨訪至妊娠結束。

5.觀察指標及判斷標準：正常受精率=正常受精卵數/受精卵總數×100%；D3優質胚胎率=優質胚胎數/正常受精數×100%；囊胚形成率=囊胚形成數/囊胚培養數×100%；優質囊胚率=優質囊胚數/囊胚培養數×100%；種植率=著床胚胎數/移植胚胎數×100%；臨床妊娠率=臨床妊娠周期數/所有移植周期數×100%；活產率=活產周期/所有移植周期數×100%。

二、結果

1.不同DFI組患者的基本資料比較：3組患者除C組男、女方年齡顯著高于A組(P<0.05)外，其余指標如女方體質量指數(BMI)、基礎FSH(bFSH)、抗苗勒管激素(AMH)、基礎竇卵泡數(AFC)等均無顯著性差異(P>0.05)(表1)。

表1 不同DFI組患者基本資料比較

2.取卵周期中不同年齡各DFI組患者受精及胚胎發育情況比較：為盡力消除男、女方年齡對妊娠結局的干擾，將3組患者按照女方年齡分為<35歲和≥35歲進行分層分析。<35歲患者中，B、C組的優質囊胚率顯著低于A組(P<0.05)，3組間的正常受精率和優質胚胎率無顯著性差異(P>0.05)，囊胚形成率隨DFI升高有降低趨勢，但尚無顯著性差異(P>0.05)。≥35歲患者中，C組患者正常受精率顯著低于A、B組(P<0.05)，3組患者優質胚胎率無顯著性差異(P>0.05)，囊胚形成率和優質囊胚率隨DFI升高有下降趨勢，但尚無顯著性差異(P>0.05)(表2)。

表2 取卵周期中不同年齡各DFI組胚胎發育及受精情況比較(%)

3.移植周期中不同DFI組胚胎移植情況及不同年齡各DFI組妊娠結局比較：1 079個取卵周期共進行了1 441次胚胎移植(A組1 114個周期，B組281個周期和C組46個周期)。為了更加準確地分析不同DFI組患者胚胎移植后的妊娠結局，對患者移植周期的女方年齡、平均移植胚胎數和移植日子宮內膜厚度進行比較，3組間均無顯著性差異(P>0.05)(表3)。不同年齡各DFI組妊娠結局比較，A組患者種植率、臨床妊娠率和活產率均有高于其余兩組的趨勢，但尚無顯著性差異(P>0.05)(表4)。

表3 移植周期中不同DFI組患者胚胎移植情況比較

表4 不同年齡各DFI組妊娠結局比較(%)

三、討論

近年來，男性因素在輔助生殖中的作用越來越受到人們的重視。精子非整倍體、表觀遺傳學特征、精蛋白及組蛋白等因素都可能影響胚胎質量甚至妊娠結局[11]，精子DFI被認為是一種評估男性生育力的有力指標[12]。但精子DFI檢測方法眾多，加之研究人群和方法不盡相同，針對DFI的具體影響仍然存在爭論。本研究將患者按照不同DFI進行分組，比較各組間妊娠結局的差異，探討DFI對于輔助生殖結局的影響。

研究結果顯示，當女方年齡≥35歲時，DFI增加會顯著降低患者的正常受精率，提示在高齡患者中，DFI過高可能影響精子的受精能力。有研究表明，精子DFI與精子活力和形態存在一定相關性，這可能是導致其受精能力降低的主要原因[13]。3組的優質胚胎率并無顯著性差異(P>0.05)。隨著精子DFI升高，囊胚形成率和優質囊胚率有下降趨勢，但尚無統計學差異(P>0.05)，這可能與樣本量相對不足有關，有待后續進一步擴大樣本量的研究。對于年齡<35歲的患者，精子DFI的升高并不會降低患者的正常受精率，但行囊胚培養時，DFI≤15%組患者的優質囊胚率顯著高于15%

本研究對患者移植周期的妊娠結局進行比較發現，不同年齡段的女性各DFI組的種植率、臨床妊娠率和活產率并無顯著性差異(P>0.05)，提示在移植周期中，DFI的增加對患者最終妊娠結局無明顯影響。既往研究認為，配偶精子DFI數值高的女性復發性流產率顯著高于其配偶精子DFI數值較低者(P<0.05)[17]。但近年來也有研究得出不同結論[18-19]，Brahem等[20]發現經過密度梯度洗滌和上游處理后的精子DFI會顯著降低；王青欣等[21]則認為處理后的精子在DFI和活力方面均得到明顯改善，因此洗滌前的精子DFI檢測價值有限。另外，女性卵泡的修復作用不容忽視，卵母細胞能夠在整個卵子發生過程中修復DNA損傷，并提供基因產物，負責修復受精后兩個親本基因組的DNA損傷[22-23]。因此，在多種復雜因素的作用下，精子DFI對最終妊娠結局的直接影響較為有限。

綜上所述，本研究通過比較不同DFI患者IVF的妊娠結局發現，雖然DFI對患者IVF-ET妊娠結局存在一定的影響，但其對臨床妊娠率和活產率等的影響較為有限。目前關于精子DFI 對IVF-ET妊娠結局的影響仍難有定論，需要多中心、更大樣本量的前瞻性研究加以探討。