血清lncRNA MEG3的表達與多囊卵巢綜合征患者胰島素抵抗的關系

崔潁君，張華美，閆磊，王智，張春曉，隋清，王紅梅，陳瀟菲*

(德州市婦女兒童醫院 1.檢驗科；2.產前診斷中心；3.內科；4.生殖健康科，德州 253000)

多囊卵巢綜合征(PCOS)是生殖期女性最常見的內分泌疾病，也是導致不孕癥的最重要原因[1]，PCOS以雄激素過多、排卵少和卵巢多囊性改變為特征。PCOS的全球患病率為6%～10%[2-3]，每15名女性中就有1人受到影響，超過三分之二的PCOS女性還表現出胰島素抵抗(IR)和代償性高胰島素血癥[4]，超出了由她們的肥胖程度所決定的水平，增加了這些女性患2型糖尿病和代謝綜合征的風險[5]。

PCOS的發展是一個復雜的過程，涉及多種內外因素。除了編碼蛋白質產物的mRNA外，人類基因組還轉錄大量非編碼RNA(non-coding RNA，ncRNA)，這些ncRNA在所有或最關鍵的生理和病理過程中發揮關鍵作用。某些類型的ncRNA，如miRNA在PCOS中的表達模式和功能已被報道[6]。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是由200多個核苷酸組成的ncRNA的一個亞群[7]，目前關于lncRNA的研究較少。有研究表明lncRNA可直接與多個RNA分子或蛋白質作用，參與調控表觀遺傳、轉錄和轉錄后的基因表達[8]。lncRNA人類母系表達基因3(maternally expressed gene 3，MEG3)是近年來新發現的一種ncRNA，有研究表明其在多種人類疾病中發揮著關鍵作用，可作為腫瘤治療的靶點和預后判斷的生物標志物[9]，而其與PCOS的關系尚不清楚。本研究通過檢測血清中lncRNA MEG3的表達情況，分析lncRNA MEG3在PCOS病程發展中的作用及與IR的關系。

資料與方法

一、研究對象

選取2018年7月至2020年8月本院收治的PCOS患者為研究對象，進行前瞻性分析。

納入標準：符合PCOS診斷標準[10]，符合下述3項中的2項：(1)有高雄激素的臨床表現或高雄激素血癥；(2)經過超聲檢查為卵巢多囊性改變，一側或雙側卵巢內有≥12個直徑為2～9 mm的卵泡，或卵巢體積≥10 cm2；(3)稀發排卵或無排卵。

排除標準：近期或長期服用激素類藥物；合并子宮內膜異位癥、卵巢早衰、惡性腫瘤、糖尿病、高血壓等疾病；嚴重心、肝、腎等器官功能障礙；合并其他內分泌紊亂性疾病；臨床資料不完整者。

共納入符合標準的123例PCOS患者。根據胰島素抵抗指數(HOMA-IR)水平分為IR組(HOMA-IR≥2.69，n=54)和非IR組(HOMA-IR<2.69，n=69)。另選取同期來本院體檢的健康女性85例為對照組。

本研究經我院道德倫理委員會批準通過。所有樣本采集均取得受試者知情同意。

二、研究方法

1.主要試劑與儀器：Nano Drop 2000超微量分光光度計(Thermo Scientific，美國)；Abbott c16000全自動生化分析儀(雅培，美國)；Cobas e 601全自動電化學發光免疫分析儀(羅氏，瑞士)；RNA提取試劑盒(北京天根生化科技)；熒光定量PCR儀(Applied Biosystems，美國)；AceQ qRPCR SYBRGreen Mix(南京諾唯贊生物)。

2.血清采集：所有受試者在月經前3日采集空腹靜脈血10 ml，置于促凝管中室溫靜置15 min后，3 500 r/min離心處理10 min，取上層血清置于EP管內，置于-80℃保存備用。

3.臨床資料收集及生化指標測定：收集所有研究對象的臨床資料，測量和記錄年齡、身高、體重、體質量指數(BMI)、腰臀比(WHR)；采用全自動生化儀檢測空腹血糖(FBG)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)水平；化學發光儀檢測雌二醇(E2)、睪酮(T)、空腹胰島素(FINS)；采用穩態HOMA-IR評價IR狀況。HOMA-IR=FBG×FINS/22.5，HOMA-IR≥2.69定義為IR[11]。

4.實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測血清中lncRNA MEG3表達水平：采用TRIzol試劑提取血清總RNA，檢測純度后取1 μg總RNA作為模板，采用反轉錄試劑盒進行反轉錄獲得cDNA。以cDNA為模板進行擴增。反應體系為：正、反向引物各1 μl，AceQ qPCR SYBRGreen Mix 10 μl，50 ng/μl的cDNA模板1 μl，無RNA酶的滅菌水3 μl。反應條件：95℃下預變性10 min；然后以95℃ 30 s、95℃ 10 s、60℃ 15 s、72℃ 30 s的條件進行，共設35個循環。以GAPDH為內參基因，引物序列見表1。所有條件均按照檢測系統嚴格進行。采用2-ΔΔCT法對血清lncRNA MEG3表達水平進行定量分析。

表1 qRT-PCR引物序列

三、統計學分析

結 果

一、患者一般資料比較

共納入符合標準的123例PCOS患者，其中非IR組(HOMA-IR<2.69)69例、IR組(HOMA-IR≥2.69)54例。

對照組、IR組、非IR組間年齡、BMI差異均無統計學意義(P>0.05)。WHR、TG、TC、LDL-C、FINS、T水平在IR組顯著高于非IR組和對照組(P<0.05)，非IR組顯著高于對照組(P<0.05)；HDL-C、FBG、E2水平在IR組顯著低于非IR組和對照組(P<0.05)，非IR組顯著低于對照組(P<0.05)(表2)。

表2 患者一般臨床資料比較

二、各組中lncRNA MEG3和HOMA-IR水平比較

血清lncRNA MEG3水平在IR組顯著低于非IR組和對照組(P<0.05)，非IR組顯著低于對照組(P<0.05)；HOMA-IR水平在IR組顯著高于非IR組和對照組(P<0.05)，非IR組顯著高于對照組(P<0.05)(表3)。

表3 各組中lncRNA MEG3和HOMA-IR水平比較(-±s)

三、PCOS患者血清中lncRNA MEG3水平與HOMA-IR及其他生化指標的相關性分析

PCOS患者血清中lncRNA MEG3表達水平與HOMA-IR、WHR、TG、TC、LDL-C、FINS、T呈負相關(P<0.05)，與HDL-C、FBG、E2呈正相關(P<0.05)(表4)。

表4 PCOS患者血清lncRNA MEG3水平與相關指標的相關性

四、Logistic回歸分析PCOS患者IR的影響因素

以是否發生IR為因變量，lncRNA MEG3、WHR、TG、TC、LDL-C、FINS、T、HDL-C、FBG、E2為自變量，進行Logistic回歸分析。結果顯示，lncRNA MEG3為PCOS患者發生IR的影響因素(P<0.05)(表5)。

表5 多因素Logistic回歸分析IR的影響因素

五、血清lncRNA MEG3水平預測PCOS患者IR的診斷價值

繪制血清lncRNA MEG3表達水平預測PCOS患者IR發生的ROC曲線，其曲線下面積(AUC)為0.946[95%CI(0.889，0.978)]，對應的敏感度為98.15%，特異度為85.51%(圖1)。

圖1 血清lncRNA MEG3表達水平預測PCOS患者IR發生的ROC曲線

討 論

PCOS作為一種常見的內分泌紊亂性疾病，見于約10%的育齡期女性中[12]。PCOS不僅是生殖內分泌疾病，也是代謝紊亂性疾病。PCOS患者常伴有肥胖，其內臟脂肪的增加降低了胰島素的敏感性而導致IR發生[13]，IR可引起患者體內血糖、血脂代謝紊亂、雄激素升高，這也是患者發生代謝紊亂的初步表現，增加了糖尿病以及心血管疾病發生的風險，嚴重損害女性身心健康[12，14]。

研究表明lncRNA在PCOS的發生發展中發揮重要的調控作用[15]。lncRNA通常由200個以上的核苷酸組成，被稱為內源性細胞RNA。越來越多的研究表明lncRNA是一種功能性分子，通過多種機制調控基本的生物過程，是發育、分化、細胞增殖以及凋亡的關鍵調控因子，并在糖尿病、心血管疾病和腫瘤等疾病的發生發展中產生重要影響[16-17]。MEG3是核苷酸長度大于1.6 Kb的lncRNA，位于人類染色體14q32上。MEG3可在多種正常組織中表達，如肝臟、胎盤、大腦、胰腺等。因為在一些腫瘤和腫瘤細胞系中發現MEG3表達的缺失，因此其被認為是一種腫瘤抑制因子，MEG3的過度表達會導致細胞生長停滯并促進細胞凋亡[18]。本研究結果顯示，IR組患者血清lncRNA MEG3表達水平顯著低于非IR組，非IR組又顯著低于對照組；IR組的HOMA-IR水平顯著高于非IR組和對照組(P均<0.05)；Pearson法相關分析表明PCOS患者血清lncRNA MEG3表達水平與HOMA-IR、WHR、TG、TC、LDL-C、FINS、T呈負相關，與HDL-C、FBG、E2呈正相關(P均<0.05)。提示lncRNA MEG3可能通過影響IR及血脂、激素水平，引發機體代謝紊亂，進而在PCOS的發生、發展過程中發揮一定作用。多因素回歸分析發現lncRNA MEG3為PCOS發生IR的影響因素(P<0.05)；ROC曲線顯示，血清lncRNA MEG3表達水平預測PCOS患者IR發生的AUC為0.946[95%CI(0.889，0.978)]，對應的敏感度為98.15%，特異度為85.51%。這些結果均提示lncRNA MEG3可能參與PCOS及IR的發生和發展，且可作為判斷PCOS患者IR發生的血清學指標。

綜上所述，在PCOS患者血清中lncRNA MEG3表達水平降低，且其表達水平與HOMA-IR呈負相關；lncRNA MEG3與IR發生以及血脂、激素水平異常密切相關，其可能通過與機體內糖脂等代謝異常相互作用進而影響PCOS的發生和發展。lncRNA MEG3有望成為判斷PCOS疾病進展的血清學指標，但后續仍需要進一步完善研究設計加以探討。