“廢棄”胚胎繼續(xù)囊胚培養(yǎng)及其妊娠結(jié)局分析

范麗娟，施文浩，文雯，梁思瑞，陳琰睿，趙皖秋，孟彬，趙靜，周寒鷹*

(1.西北婦女兒童醫(yī)院生殖中心，西安 710003；2.陜西省婦科疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，西安 710003；3.西安醫(yī)學(xué)院，西安 710021；4.西安市第四醫(yī)院生殖中心，西安 710005)

胚胎形態(tài)學(xué)評(píng)分是目前使用最廣泛的評(píng)估胚胎發(fā)育潛能的方法。胚胎培養(yǎng)第3天(D3)評(píng)分為Ⅳ級(jí)和F級(jí)胚胎被認(rèn)為是發(fā)育潛能差的“廢棄”胚胎[1-2]。接受體外受精-胚胎移植(IVF-ET)治療的患者中有約6.3%的患者因未形成可利用胚胎不得不取消周期[3]。IVF-ET治療費(fèi)用較高，無可移植胚胎可能對(duì)患者造成較重的經(jīng)濟(jì)和心理負(fù)擔(dān)。

胚胎形態(tài)學(xué)評(píng)分有一定局限性，其受主觀因素影響較大，因其對(duì)早期胚胎的動(dòng)態(tài)發(fā)育過程關(guān)注較少，導(dǎo)致對(duì)早期胚胎發(fā)育潛能的預(yù)測(cè)可能存在缺陷。有文獻(xiàn)報(bào)道，即使“廢棄”胚胎亦有一定的利用價(jià)值，其囊胚形成率為17.45%～36.79%，優(yōu)質(zhì)囊胚形成率為9.38%～10.38%[4-5]。由“廢棄”胚胎養(yǎng)成的囊胚移植后有可能獲得臨床妊娠并分娩正常新生兒[4]。試管嬰兒作為非自然狀態(tài)下受孕出生的嬰兒，其健康問題受到廣泛關(guān)注。本研究回顧性分析“廢棄”胚胎行囊胚“試培養(yǎng)”及移植后的妊娠結(jié)局，以期探討“廢棄”胚胎行囊胚“試培養(yǎng)”的臨床價(jià)值。

資料與方法

一、研究對(duì)象

回顧性分析2015年1月至2020年1月于西北婦女兒童醫(yī)院生殖中心行第1次IVF/ICSI-ET治療患者的臨床資料。

納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)IVF或ICSI授精后雙原核(2PN)率≥50%；(2)因所有卵裂期胚胎均為Ⅳ級(jí)或F級(jí)而行囊胚“試培養(yǎng)”。

排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)女方合并存在子宮畸形、輸卵管積液及子宮內(nèi)膜異位癥等影響胚胎移植結(jié)局的疾病；(2)行胚胎植入前遺傳學(xué)檢測(cè)(PGT)的患者。

本研究共納入246例患者，根據(jù)囊胚“試培養(yǎng)”結(jié)局不同分為成功組(54例)和失敗組(192例)，比較兩組患者的基礎(chǔ)資料及獲卵情況；同時(shí)，將成功形成囊胚并移植的患者根據(jù)其移植周期不同分為新鮮移植組(41例)和凍融移植組(10例)，觀察兩組患者的妊娠結(jié)局。

二、研究方法

1.胚胎評(píng)分與囊胚培養(yǎng)：患者促排卵后，當(dāng)2/3以上優(yōu)勢(shì)卵泡直徑發(fā)育至17 mm時(shí)使用重組HCG(默克雪蘭諾，意大利)或人源HCG(珠海麗珠)進(jìn)行扳機(jī)。34～36 h后，在陰道B超引導(dǎo)下行經(jīng)陰道穿刺負(fù)壓抽吸取卵術(shù)。女方取卵當(dāng)日，男方取精，根據(jù)不同精液參數(shù)標(biāo)準(zhǔn)，選擇IVF或ICSI授精。授精后16～18 h對(duì)胚胎的PN數(shù)目進(jìn)行觀察及評(píng)分。D3觀察卵裂期胚胎培養(yǎng)情況并進(jìn)行分級(jí)評(píng)分。卵裂期胚胎評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下：胚胎分為5級(jí)：Ⅰ級(jí)：8～10細(xì)胞，卵裂球均勻，胞質(zhì)均勻透亮，透明帶完整，胚胎無碎片或有少量(<10%)碎片；Ⅱ級(jí)：6～7細(xì)胞或>10細(xì)胞，卵裂球稍不均，碎片10%～20%，透明帶完整；Ⅲ級(jí)：4～5細(xì)胞，卵裂球稍不均，碎片20%～50%，透明帶完整；Ⅳ級(jí)：碎片>50%，卵裂球不均；F級(jí)：無明顯卵裂球存在，觀察到大量無核碎片。本研究中所有患者的卵裂期胚胎評(píng)分均為Ⅳ級(jí)或F級(jí)，應(yīng)患者要求并知情同意后將“廢棄”胚胎行囊胚培養(yǎng)(培養(yǎng)液G-serious，Vitrolife，瑞典)。囊胚評(píng)級(jí)參照Gardner囊胚分級(jí)法，將D5評(píng)分在3CC以上的囊胚定義為可利用囊胚，≥3BB定義為優(yōu)質(zhì)囊胚。

2.囊胚移植與黃體支持：囊胚移植包括新鮮周期移植和凍融周期移植，取決于患者基礎(chǔ)情況、促排卵方案、囊胚情況(按照我中心常規(guī)D6囊胚僅行冷凍移植)及自身意愿。每位患者移植囊胚數(shù)目為1～2枚。囊胚移植后每日用黃體酮凝膠(雪諾同，德國)90 mg陰道給藥或黃體酮軟膠囊(安琪坦，法國)0.6 g陰道給藥，同時(shí)每日口服地屈孕酮(雅培，美國)20 mg。囊胚移植后第12天測(cè)血HCG，若陽性則于移植后第26天行盆腔超聲。B超下見孕囊者為臨床妊娠；僅HCG陽性而后期B超未見孕囊者為生化妊娠。孕11周停止黃體支持。

3.觀察指標(biāo)及計(jì)算方法：主要觀察指標(biāo)為囊胚形成率和活產(chǎn)率；次要觀察指標(biāo)包括優(yōu)質(zhì)囊胚形成率、HCG陽性率、臨床妊娠率、流產(chǎn)率及早產(chǎn)率。其中：囊胚形成率=形成可利用囊胚數(shù)/行囊胚培養(yǎng)卵裂期胚胎數(shù)×100%；活產(chǎn)率=活產(chǎn)周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%；優(yōu)質(zhì)囊胚形成率=形成優(yōu)質(zhì)囊胚數(shù)/行囊胚培養(yǎng)卵裂期胚胎數(shù)×100%；HCG陽性率=HCG陽性周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%；臨床妊娠率=臨床妊娠周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%；流產(chǎn)率=流產(chǎn)周期數(shù)/臨床妊娠周期數(shù)×100%；早產(chǎn)率=早產(chǎn)周期數(shù)/活產(chǎn)周期數(shù)×100%。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、2PN“廢棄”胚胎囊胚培養(yǎng)情況

本研究共納入患者246人，共246個(gè)周期；D3均無可移植胚胎，將2PN“廢棄”胚胎行囊胚培養(yǎng)后，54個(gè)周期(54人)獲得可利用囊胚：684枚2PN“廢棄”胚胎培養(yǎng)形成囊胚65枚，囊胚形成率9.50%；其中優(yōu)質(zhì)囊胚40枚，優(yōu)質(zhì)囊胚形成率為5.85%。

二、“試培養(yǎng)”成功組與失敗組患者基礎(chǔ)資料及獲卵情況比較

如表1所示，“試培養(yǎng)”成功組與失敗組的女方年齡、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、不孕時(shí)間、不孕因素分類占比、基礎(chǔ)激素水平(FSH、LH)、基礎(chǔ)竇卵泡數(shù)(AFC)及獲卵數(shù)比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)?！霸嚺囵B(yǎng)”成功組原發(fā)性不孕占比為57.41%，顯著低于“試培養(yǎng)”失敗組(74.48%)(P<0.05)。

表1 “試培養(yǎng)”成功組和失敗組基礎(chǔ)資料及獲卵情況比較

三、“試培養(yǎng)”形成囊胚后不同移植周期的妊娠情況

54例患者獲得囊胚后，41例患者行新鮮周期囊胚移植(新鮮移植組)，13例患者因基礎(chǔ)情況、促排卵方案和自身意愿取消新鮮周期移植，囊胚冷凍保存?zhèn)溆?。新鮮移植組的41例患者中22例患者HCG陽性，且均獲得臨床妊娠，臨床妊娠率為53.66%。2例孕12周前自然流產(chǎn)。僅1例患者孕36周早產(chǎn)，余臨床妊娠患者均足月產(chǎn)。新鮮周期移植活產(chǎn)率為48.78%?；町a(chǎn)25例新生兒均未發(fā)現(xiàn)出生缺陷(表2)。

截至2020年1月，共11例患者行囊胚復(fù)蘇，其中1例患者囊胚復(fù)蘇失敗未移植，余10例患者囊胚復(fù)蘇成功，行凍融囊胚移植(凍融移植組)，其中2位患者1次凍融移植2枚囊胚。在復(fù)蘇的12枚囊胚中8枚為D6囊胚。7例患者HCG陽性，其中2例生化妊娠，5例臨床妊娠。3例患者孕2月余自然流產(chǎn)。最終2例患者足月分娩新生兒，均未發(fā)現(xiàn)出生缺陷(表2)。因本研究目的不涉及“廢棄”胚胎試培養(yǎng)后不同移植周期的優(yōu)劣，故僅對(duì)此部分資料進(jìn)行描述，并未進(jìn)行組間比較。

表2 “試培養(yǎng)”形成囊胚后不同移植周期的妊娠情況

討 論

臨床工作中，被常規(guī)評(píng)價(jià)視為“廢棄”胚胎的一般包括兩類：異常受精的胚胎和胚胎評(píng)分極低的2PN胚胎[4]。本研究?jī)H選用授精后16～18 h觀察到胚胎內(nèi)存在明確的2PN及2個(gè)極體(PB)的“廢棄”胚胎行囊胚培養(yǎng)。部分1PN和0PN(2PB)胚胎可能是因?yàn)殄e(cuò)過了最佳觀察時(shí)機(jī)，被誤認(rèn)為是異常受精，有文獻(xiàn)報(bào)道0PN和1PN胚胎的囊胚形成率分別為30.03%和17.09%[6]，但其整倍體率低，不建議移植[7]。

既往研究認(rèn)為高齡女性AFC、獲卵數(shù)少、因胚胎因素引起的周期取消率高[8]。本研究所納入246例“試培養(yǎng)”患者平均年齡(31.31±4.57)歲，“試培養(yǎng)”成功組和失敗組平均年齡分別為(31.06±4.03)歲和(31.38±4.67)歲，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。本研究結(jié)果未發(fā)現(xiàn)年齡是“試培養(yǎng)”失敗的危險(xiǎn)因素。“試培養(yǎng)”失敗組原發(fā)性不孕占比74.48%，顯著高于“試培養(yǎng)”成功組。這可能與原發(fā)性不孕患者存在更高的胚胎發(fā)育阻滯和卵子異常等風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)[9-10]。

本研究中2PN“廢棄”胚胎囊胚形成率為9.50%，低于余柯達(dá)等[4]報(bào)道的17.45%和王治鴻等[5]報(bào)道的36.79%；優(yōu)質(zhì)囊胚形成率為5.85%，低于余柯達(dá)等[4]報(bào)道的9.38%和王治鴻等[5]報(bào)道的10.38%，原因可能包括兩方面：第一，胚胎形態(tài)學(xué)評(píng)分受主觀因素影響；第二，本研究?jī)H納入2PN胚胎，而其它研究納入了0PN和1PN胚胎，0PN和1PN胚胎可能只是錯(cuò)過了最佳觀察時(shí)間導(dǎo)致誤判，但其仍具有發(fā)育潛能。

本研究中41例患者行新鮮周期囊胚移植，移植后妊娠率為53.66%，活產(chǎn)率為48.78%，與本中心常規(guī)IVF-ET妊娠率和活產(chǎn)率[11]接近。11例患者行凍融囊胚移植，1例患者因解凍1枚囊胚復(fù)蘇失敗而取消移植。由2PN“廢棄”胚胎繼續(xù)囊胚培養(yǎng)后所獲得囊胚解凍復(fù)蘇成功率為92.31%，低于我中心平均囊胚解凍復(fù)蘇成功率[12]。10例患者行凍融移植后臨床妊娠率為50.00%，但自然流產(chǎn)率為60.00%(3/5)，導(dǎo)致最終活產(chǎn)率僅為20.00%(2/10)。根據(jù)現(xiàn)有研究，凍融移植并不增加自然流產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)[13]。10例行凍融囊胚移植的患者中，7例患者移植D6囊胚，僅3例患者移植D5囊胚。本中心前期研究結(jié)果顯示，D6囊胚整倍體率低于D5囊胚[14]。因此我們認(rèn)為，本研究中凍融移植周期流產(chǎn)率高一方面可能是由于D6囊胚占比高所致，另一方面可能是由于回顧性研究樣本選擇性偏倚所致。

輔助生殖技術(shù)的子代安全性一直受到關(guān)注[15]。雖然本研究中所移植的囊胚均來自“廢棄”胚胎，但子代均未出現(xiàn)出生缺陷。提示來自“廢棄”胚胎所形成的囊胚移植后子代安全性尚可，利用2PN“廢棄”胚胎繼續(xù)培養(yǎng)囊胚后移植，不失為D3無可移植胚胎患者一種補(bǔ)救的治療方法。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，D3評(píng)分未達(dá)標(biāo)的“廢棄”卵裂期胚胎經(jīng)過“試培養(yǎng)”后有9.5%的囊胚形成率以及新鮮周期移植后53.66%的妊娠率。提示常規(guī)的D3卵裂期評(píng)分存在一定的主觀局限性，可能對(duì)一小部分胚胎進(jìn)行誤判。因此，臨床上對(duì)于D3無可移植胚胎的患者，利用“廢棄”胚胎行囊胚“試培養(yǎng)”不失為一種補(bǔ)救治療的方法，但其安全性和有效性尚需要大樣本隨機(jī)對(duì)照研究加以證實(shí)。