太原地區(qū)910例孕婦脊髓性肌萎縮癥攜帶者篩查及一例家系驗證

鄧洋，郭進(jìn)升，張眉花

(太原市婦幼保健院婦科，太原 030012)

脊髓性肌萎縮癥(Spinal muscular atrophy，SMA)是以脊髓前角細(xì)胞為主的變性以及α-運動神經(jīng)元的進(jìn)行性死亡引起的一種常染色體隱性遺傳疾病，表現(xiàn)為進(jìn)行性、對稱性、肢體近端為主的肌張力減退、肌無力、肌萎縮。傳統(tǒng)觀念認(rèn)為該病僅累及下運動神經(jīng)元，近年來，越來越多研究表明SMA是一種多系統(tǒng)受累疾病，主要包括心血管、消化、代謝、內(nèi)分泌等系統(tǒng)，嚴(yán)重時可以導(dǎo)致患者呼吸衰竭、死亡，位居2歲以下兒童致死遺傳病的首位[1]。SMA具有種族差異性，歐美人群中SMA的發(fā)病率為1/6 000～10 000，攜帶者頻率為1/40～1/50[2]，中國臺灣地區(qū)人群發(fā)病率為1/9 000[3]，目前統(tǒng)計到的中國人群SMA攜帶率為1/42，但暫無確切的SMA發(fā)病率數(shù)據(jù)[4-5]。

SMA致病基因為運動神經(jīng)元存活基因1(SMN1)基因，與其高度同源的SMN2基因為疾病修飾基因。所有SMA患者均存在SMN1雙等位基因突變，突變形式主要為第7或第7、8外顯子純合缺失突變，約占95%，剩余5%的SMA患者保留了一份SMN1基因突變，如錯義突變、小插入、缺失和剪接突變等[6-7]。

減少出生缺陷是我國“健康中國2030”規(guī)劃中的重要組成部分[8]。數(shù)據(jù)顯示，我國出生缺陷率約為5.6%，因我國人口基數(shù)大，每年出生缺陷新增病例高達(dá)約90萬例[9]。在SMA陽性病例家庭中，生育下一胎再發(fā)SMA的風(fēng)險為25%，并且男孩和女孩患病風(fēng)險均等。由于SMA的基因突變情況復(fù)雜，產(chǎn)前診斷前必須先進(jìn)行先證者及父母的預(yù)分析，明確先證者的SMN1突變類型，再制定在該家系中實行的產(chǎn)前診斷途徑和策略，對于減少SMA患兒的出生具有重要價值[4]。因此本研究應(yīng)用熒光定量PCR技術(shù)檢測太原市910例孕婦的SMN1基因第7外顯子和第8外顯子拷貝數(shù)變異情況，明確太原地區(qū)部分人群的SMA攜帶率；并應(yīng)用多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)(MLPA)驗證SMA陽性家系，為其提供遺傳咨詢和生育指導(dǎo)，評估出生患兒的遺傳風(fēng)險，以降低SMA患兒的出生率。

資料與方法

一、研究對象

收集2020年1月至2021年4月在我院就診的孕婦為研究對象，共910例，對其進(jìn)行SMA攜帶者篩查。納入標(biāo)準(zhǔn)：無SMA臨床表現(xiàn)，無其他神經(jīng)肌肉系統(tǒng)疾病，年齡在18～45歲，孕周<21周，身心健康，無心血管、內(nèi)分泌系統(tǒng)及其他重要臟器的妊娠合并癥。本研究通過本院醫(yī)學(xué)倫理審查委員會評審批準(zhǔn)，所有研究對象檢測前均充分知情同意并簽署知情同意書。

二、研究方法

1.樣本取材及檢測指標(biāo)：所有受檢者提供外周血樣本，夫妻雙方均為攜帶者的受檢者提供絨毛/羊水穿刺樣本。SMA攜帶的孕婦，對其丈夫進(jìn)行SMN1基因檢測。對明確SMA的患者進(jìn)行家系驗證，并對高風(fēng)險胎兒進(jìn)行產(chǎn)前診斷。

2.外周血采集：采集研究對象外周靜脈血2 ml，用于提取血液基因組DNA。

3.絨毛穿刺樣本：對懷孕10～12周孕婦進(jìn)行腹壁絨毛活檢術(shù)獲取其絨毛組織。

4.基因組DNA提?。和ㄟ^磁珠DNA提取方法提取外周血樣本中的基因組DNA：使用天隆NP968核酸提取儀以及天隆核酸提取試劑進(jìn)行DNA提取；應(yīng)用組織DNA提取試劑盒(easyPureGenomic DNA Kit，EE101-11)提取絨毛穿刺樣本中的絨毛組織DNA。提取的基因組DNA用Nanodrop 2000儀(Thermo Fisher Scientific，美國)進(jìn)行純度和濃度分析，并按照實驗檢測要求稀釋樣本，獲得合格的用于檢測的DNA樣本。

5.實時熒光定量PCR檢測：本研究應(yīng)用SMN1外顯子缺失檢測試劑盒(上海五色石醫(yī)學(xué))對提取到的基因組DNA進(jìn)行SMN1基因第7/8外顯子擴(kuò)增并對拷貝數(shù)進(jìn)行相對定量檢測，同時采用化學(xué)阻斷方法控制SMN2對檢測結(jié)果的影響。按照試劑盒套組說明書操作：取出試劑盒，將試劑盒組分平衡至室溫，根據(jù)當(dāng)次實驗所進(jìn)行的反應(yīng)數(shù)(標(biāo)本DNA、1個空白對照、1個缺失對照及3個梯度正常對照)計算并移取相應(yīng)試劑，按照試劑盒方案配制反應(yīng)體系，按照以下條件進(jìn)行PCR 擴(kuò)增：95℃，10 min；95℃，15 s；58℃退火與延伸40個循環(huán)，實時收集熒光信號，記錄并計算實驗結(jié)果。

6.MLPA檢測：使用MLPA P060試劑盒(SALSA MLPA Kit P060-B2，MRC-Holland，荷蘭)對提取的絨毛組織基因組DNA樣本進(jìn)行實驗，驗證SMN1基因拷貝數(shù)變異。按照MLPA試劑盒檢測流程進(jìn)行操作：DNA變性與探針雜交；連接反應(yīng)；擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分析采用ABI 3500xl毛細(xì)管電泳儀(Thermo Fisher Scientific，美國)，得到的數(shù)據(jù)用Coffalyser V8.0軟件分析。

結(jié) 果

一、910例孕婦SMA攜帶者篩查

納入的910例孕婦，年齡20～42歲，平均年齡(29.43±3.66)歲，孕周11～20周，平均孕周(16.00±2.47)周。進(jìn)行熒光定量PCR檢測顯示，有20例孕婦SMN1基因7、8號外顯子雜合缺失，890例孕婦SMN1基因7、8號外顯子無缺失(熒光定量PCR擴(kuò)增曲線如圖1示)。提示太原地區(qū)我院孕產(chǎn)婦人群中攜帶者頻率為1∶46，即人群每46例中有1例SMA攜帶者。對20例攜帶者進(jìn)行遺傳咨詢后，其配偶都自愿接受SMA篩查，最終有3對夫婦均為SMA攜帶者，其中有1對不配合后續(xù)檢測，另外2對完善相關(guān)檢測結(jié)果顯示：1對夫婦育有1例SMA患兒，并且二胎胎兒進(jìn)行產(chǎn)前診斷為SMN1基因7、8號外顯子雜合缺失，SMN2基因7、8號外顯子雜合重復(fù)，即SMA攜帶者；另1對夫婦進(jìn)行產(chǎn)前診斷，最終提示胎兒為SMN1基因7、8號外顯子雜合缺失。

二、MLPA驗證SMA攜帶者家系

本研究納入1例SMA攜帶者家系，采用MLPA技術(shù)結(jié)合毛細(xì)管電泳方法，分析先證者(2歲)及其母親(22歲)、父親(23歲)、二胎胎兒(胎齡14周)SMA致病基因第7和第8外顯子缺失與重復(fù)情況。其中先證者母親為SMN1基因第7和第8外顯子雜合缺失，未發(fā)現(xiàn)SMN2基因7、8號外顯子存在變異；先證者父親為SMN1基因第7和第8外顯子雜合缺失，SMN2基因7、8號外顯子重復(fù)變異；二胎胎兒為SMN1基因第7和第8外顯子雜合缺失，SMN2基因7、8號外顯子重復(fù)變異。先證者為SMN1基因第7和第8外顯子純合缺失，SMN2基因7、8號外顯子重復(fù)變異(表1)。

表1 MLPA驗證SMA攜帶者家系SMN1、SMN2基因

先證者SMA患兒臨床表型信息顯示：其肌張力低、肌力檢查不合作，膝腱反射未引出，跟腱反射未引出，病理征未引出，扶立時下肢支撐差；常規(guī)肌電圖提示神經(jīng)源性損害，核磁共振平掃顯示額前間隙增寬，腦電圖發(fā)育可疑異常。之前進(jìn)行0～1神經(jīng)運動檢查結(jié)果顯示：先證者眼球能追視紅球和人臉，眼和頭能轉(zhuǎn)動180°；有對聲音的反應(yīng)；沒有非對稱性緊張性反射(ATNA)；無持續(xù)手握拳，有拉坐姿勢，俯臥位抬頭和手支撐異常；內(nèi)收肌角角度左加右105°，腘窩角右側(cè)100°，左側(cè)90°，足背屈角右側(cè)角度快和慢均，左側(cè)角度快和慢均；不能獨坐30 s，手不能主動抓握，不能主動爬，無側(cè)面支撐反應(yīng)，無降落傘反應(yīng)，可以翻身，膝反射正常，立位懸垂反應(yīng)正常，俯臥位懸垂反應(yīng)正常。

討 論

SMA是一種不可治愈的常染色體隱性遺傳的運動神經(jīng)元疾病，對于SMA患者越早診斷，越早開始有效治療，預(yù)后越好。目前反義寡核苷酸藥物諾西那生鈉(Nusinersen)用于治療l型、2型SMA，于2019年獲得中國國家藥品監(jiān)督管理局(NMPA)正式批準(zhǔn)[10-13]。利司撲蘭(Risdiplam)通過雙位點特異性調(diào)控SMN2基因(SMN1同源基因)的剪接，促進(jìn)保留外顯子7，提高功能性SMN蛋白水平[13-14]，在2021年6月由NMPA正式批準(zhǔn)用于治療2月齡及以上SMA患者。隨著SMA治療創(chuàng)新藥物的不斷出現(xiàn)，通過SMN1基因檢測明確病因，對SMA患兒精準(zhǔn)治療具有重要意義。SMN1基因突變目前常用的檢測方法有：MLPA、qPCR、PCR/限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性(RFLP)以及變性高效液相色譜(DHPLC)，這些方法不僅可以檢測SMN1基因拷貝數(shù)變異還可以檢測SMN1基因微缺失；高通量測序(NGS)技術(shù)用于檢測SMN1基因內(nèi)是否存在點突變、錯義突變等其他微小突變[15]。對SMA患兒進(jìn)行臨床表型和SMN1基因拷貝數(shù)特點進(jìn)行分析，將有助于SMA患兒的早期診斷、輔助治療和遺傳咨詢，特別是對預(yù)防先證者家庭再次生育 SMA患兒具有重要意義。

考慮到一般人群中攜帶SMA的頻率相對較高，美國、以色列等國家已將SMA攜帶者篩查列為常規(guī)篩查項目[16-17]，開展SMA攜帶者篩查工作是降低出生缺陷發(fā)生率的重要方面。目前國內(nèi)數(shù)據(jù)尚缺乏SMA發(fā)病率的大樣本量、多中心、大規(guī)模的統(tǒng)計數(shù)據(jù)，現(xiàn)有部分地區(qū)進(jìn)行了相關(guān)統(tǒng)計，如中國臺灣地區(qū)的SMA攜帶率約為22‰，中國香港地區(qū)約為16‰，上海為19‰，柳州為12‰，江蘇為17.3‰[18-19]。本研究統(tǒng)計了太原地區(qū)部分人群的SMA攜帶率為21.98‰，與國內(nèi)其他地區(qū)人群相近。

綜上，對于SMA家庭來說，在遺傳咨詢中進(jìn)行合理的風(fēng)險評估是十分必要的，產(chǎn)前診斷預(yù)防也是目前減輕疾病負(fù)擔(dān)的重要手段。針對SMA的產(chǎn)前診斷可以快速、準(zhǔn)確作出判斷，尤其針對有陽性家族史的孕婦采取SMN1基因檢測手段可以降低SMA患兒的出生，提高出生人口的質(zhì)量。