枳術(shù)丸對(duì)功能性消化不良的治療作用機(jī)制探討

何凡應(yīng)，徐汪君，黃柳向

1 湖南中醫(yī)藥大學(xué) 湖南長(zhǎng)沙 410208

2 湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 湖南長(zhǎng)沙 410007

功能性消化不良是指由胃和十二指腸功能紊亂引起的癥狀，而無器質(zhì)性疾病的一組臨床綜合征，臨床主要表現(xiàn)為上腹部脹滿、疼痛不適，食欲不振、惡心嘔吐、胃脘部燒灼感等不適癥狀[1]。在中醫(yī)中并無功能性消化不良病名，而是根據(jù)其臨床表現(xiàn)，將其歸屬于胃痞、胃痛范疇。素問其病位在脾胃，與肝密切相關(guān)，還可涉及肺和大腸。基本病機(jī)為肝郁氣滯，脾胃虛弱[2]。《景岳全書·痞滿》言：“怒氣暴傷，肝氣未平而痞皆有嘔證”。若平素憂思惱怒，則易傷肝損脾，脾胃受損，則不思飲食，脾胃為升降樞紐，其受損中焦升降失常，肝郁還可犯胃，甚至嘔吐，進(jìn)而發(fā)展為本病。

枳術(shù)丸由枳實(shí)、白術(shù)兩味藥組成，是由張?jiān)卦趶堉倬爸薪饏T要略的枳術(shù)湯化裁而來，藥物不變，將湯劑改制成丸劑。《金匱要略·水氣病脈證病治第十四》云：“心下堅(jiān)大如盤，邊如旋盤，水飲所作，枳術(shù)湯主治”。枳實(shí)性苦、辛、微寒，歸脾胃經(jīng)，具有破氣消積，化痰散痞之功。白術(shù)性甘苦溫，歸脾胃經(jīng)，功效為健脾益氣，燥濕利水，止汗，安胎。二者相配伍，枳實(shí)主消，白術(shù)為守，一走一守，一消一補(bǔ)，相互制約互用，共奏疏肝健脾，消食化積散痞之功。若單純健脾補(bǔ)氣而不消滯行氣，則恐補(bǔ)而壅滯， 積痞難去，若一味行氣消滯而不輔以健脾益氣， 則積滯雖可暫去，卻有再積之虞。故二者合用，健脾與行氣并施， 雙管齊下，則可達(dá)到消補(bǔ)兼施， 消而不傷正， 補(bǔ)而不礙滯之功[3]。臨床上常用其治療功能性消化不良，并取得了不錯(cuò)的效果。

為進(jìn)一步揭示枳術(shù)丸治療功能性消化不良的作用機(jī)制，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對(duì)枳術(shù)丸進(jìn)行深入挖掘。

材料與方法

1 枳術(shù)丸活性成分靶點(diǎn)的獲取

借助中醫(yī)藥系統(tǒng)藥理學(xué)平臺(tái)TCMSP（https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）[4]，在搜索框中依次輸入白術(shù)、枳實(shí)兩味中藥，得到其所有活性成分，根據(jù)人體對(duì)藥物吸收、分布、代謝及排泄的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)[5]，再篩選出高活性成分，篩選標(biāo)準(zhǔn)為：口服利用度（oral bioavailability，OB）≥ 30% 且類藥性（drug-likeness，DL）≥ 0.18，[6]并利用uniprot數(shù)據(jù)庫借助R語言將得到的活性成分統(tǒng)一轉(zhuǎn)化為規(guī)范的靶點(diǎn)。

2 功能性消化不良的靶標(biāo)的收集

利用 genencard（https：//www.genecards.org）數(shù)據(jù)庫[7]，在其搜索框中輸入功能性消化不良的英文名，即Functional dyspepsia，搜索后得到該疾病的有關(guān)靶標(biāo)，再選擇參數(shù)relevance score ＞ 10，得到與該疾病密切相關(guān)的常見靶標(biāo)。

3 枳術(shù)丸-功能性消化不良共同靶點(diǎn)的收集

利 用 在 線 畫 圖 網(wǎng) 站，（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny）將枳實(shí)、白術(shù)，功能性消化不良（Functional dyspepsia）各自的靶標(biāo)輸入其中，得到共同靶標(biāo)和韋恩圖。

4 枳術(shù)丸-功能性消化不良共同靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將得到的共同靶點(diǎn)輸入String數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org）[8]，選擇參數(shù) MultipleProtein，選定物種為Homosapiens，設(shè)定最低要求互動(dòng)分?jǐn)?shù)為中度信度0.400得到蛋白相互作用（PPI）相關(guān)信息并導(dǎo)出PPI網(wǎng)絡(luò)圖與TSV文件，運(yùn)用R語言將TSV文件目錄中node1與node2各個(gè)靶點(diǎn)的節(jié)點(diǎn)數(shù)目degree導(dǎo)出得到xsl表與柱狀圖。

5 枳術(shù)丸-功能性消化不良共同靶點(diǎn)的GO分析

運(yùn) 用 DAVID 數(shù) 據(jù) 庫（https：//david.ncifcrf.gov）[9]，對(duì)共同靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集分析，輸入格式選擇“OFFICIAL GENE SYMBOL”，“Background” 選 擇“Homo aspiens”，P＜0.05，并將 BP（生物過程）、CC（細(xì)胞成分）、MF（分子功能）分別導(dǎo)出，對(duì) P 值取負(fù)對(duì)數(shù)，P 值越小，-lgP大，表明富集程度越大。進(jìn)行GO分析，將導(dǎo)出后的結(jié)果用微生信（http：//www.bioinformatics.com.cn）在線繪制出GO富集氣泡圖。

6 枳術(shù)丸-功能性消化不良共同靶點(diǎn)的KEGG通路富集分析

運(yùn) 用 DAVID 數(shù) 據(jù) 庫（https：//david.ncifcrf.gov），對(duì)共同靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路富集分析，設(shè)置的參數(shù)同1.5項(xiàng)，將得到的前20條通路進(jìn)行通路富集分析。并用微生信（http：//www.bioinformatics.com.cn）在線繪制出KEGG通路富集氣泡圖。

結(jié) 果

1 枳術(shù)丸的活性成分及其對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)

通過TCMSP共收集到枳術(shù)丸活性成分共120種，其中枳實(shí)65種，白術(shù)55種，通過篩選共得到活性成分29種，其中枳實(shí)22種，白術(shù)7種，通過Uniprot數(shù)據(jù)庫借助R語言將其活性成分轉(zhuǎn)化為靶點(diǎn)，刪除重復(fù)靶點(diǎn)后共得到62個(gè)靶點(diǎn)，其中枳實(shí)52個(gè)，白術(shù)10個(gè)，見表1。

表1 枳術(shù)丸藥物活性成分

2 功能性消化不良的靶點(diǎn)

在genencard數(shù)據(jù)庫搜索框中輸入功能性消化不良的英文名，即Functional dyspepsia，搜索共得到2452個(gè)靶標(biāo)，選擇relevance score ＞ 10，得到與功能性消化不良密切相關(guān)的靶標(biāo)共553個(gè)。

3 疾病-藥物活性成分的共同靶點(diǎn)

將枳術(shù)丸的活性成分得到的靶標(biāo)與功能性消化不良得到的靶標(biāo)在（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny）中的list 1，list 2，list 3中分別輸入后，得到藥物疾病共同的靶點(diǎn)共23個(gè)，該靶點(diǎn)即是枳術(shù)丸對(duì)功能性消化不良起治療作用密切相關(guān)的靶點(diǎn)，同時(shí)導(dǎo)出韋恩圖，見圖1。

圖1 藥物-疾病韋恩圖

4 共同靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)

在String數(shù)據(jù)庫中將得到的藥物疾病23個(gè)共同靶點(diǎn)輸入后，設(shè)置參數(shù)完畢后，得到PPI蛋白互作關(guān)系圖并導(dǎo)出，見圖2；同時(shí)導(dǎo)出TSV數(shù)據(jù)文件，運(yùn)用R語言對(duì)文件進(jìn)行處理，得到各個(gè)靶點(diǎn)的連接節(jié)點(diǎn)數(shù)的degree的 xls表，見表 2， 其中 EGFR（degree=18）、IL6（degree=18）、VEGFA（degree=18）、CASP3（degree=16）連接節(jié)點(diǎn)均大于15，表明枳術(shù)丸可通過多個(gè)靶點(diǎn)對(duì)功能性消化不良起到治療作用。

表2 藥物疾病共同靶點(diǎn)的degree值

5 共同靶點(diǎn)的GO富集分析

23個(gè)共同靶點(diǎn)在DAVID數(shù)據(jù)庫中GO富集共得到92對(duì)BP，25對(duì)CC，28對(duì)MF，利用微生信對(duì)排在前10的BP、CC、MF在線繪制出GO富集氣泡圖，見圖3，結(jié)果顯示，共同靶點(diǎn)主要分布于細(xì)胞外間隙、細(xì)胞表面、高爾基體、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞內(nèi)體膜等細(xì)胞成分中，主要通過酶結(jié)合、同蛋白結(jié)合、類固醇結(jié)合、染色質(zhì)結(jié)合、蛋白磷酸酶結(jié)合等方式參與凋亡負(fù)調(diào)控、上皮細(xì)胞增殖、氨基酸反應(yīng)、雌二醇反應(yīng)、一氧化氮合成等生物進(jìn)程。

圖3 GO分析富集氣泡

6 共同靶點(diǎn)的KEGG通路富集分析

23個(gè)共同靶點(diǎn)在DAVID數(shù)據(jù)庫中KEGG富集共得到39條信號(hào)通路，富集程度前20位的通路見表3，KEGG富集分析氣泡圖見圖4，共同靶點(diǎn)參與的關(guān)鍵通路為癌癥途徑、HIF-1信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、麻疹信號(hào)通路等。

圖4 KEGG富集分析氣泡

表3 共同靶點(diǎn)富集的前20條通路

討 論

功能性消化不良是一種功能性疾病，臨床表現(xiàn)為消化功能改變而無器質(zhì)性病變，其病因尚未明確，可能與胃動(dòng)力及感覺異常、精神狀態(tài)、應(yīng)激因素、和環(huán)境影響有關(guān)，與HP感染的關(guān)系不密切，酸分泌亦無增加，女性患者較常見，目前西醫(yī)對(duì)其的治療主要以促胃動(dòng)力、抑制胃酸分泌、保護(hù)胃黏膜及心理疏導(dǎo)為主，治療效果一般，而中醫(yī)藥對(duì)功能性病變的疾病治療有著極大的優(yōu)勢(shì)，尤其是在改善患者的癥狀這一方面，功能性消化不良對(duì)應(yīng)中醫(yī)“胃痞”“胃痛”范疇，《素問·六云正紀(jì)大論》云：“木郁發(fā)之……民病胃脘當(dāng)心而痛”肝郁氣滯，脾胃虛弱乃其基本病機(jī)。臨床研究發(fā)現(xiàn)枳術(shù)丸及其衍變方對(duì)功能性消化不良的治療效果良好，李曉玲等人研究發(fā)現(xiàn)枳術(shù)丸對(duì)碘酰胺誘導(dǎo)的功能性消化不良大鼠具有加快胃排空、降低胃腸感覺過敏的作用，其機(jī)制可能與外周血Ghrelin、5-HT含量提高，CGRP含量降低有關(guān)[10]，沈一山等人將64名功能性消化不良的患者分為橘皮枳術(shù)丸組、嗎丁啉組，治療后發(fā)現(xiàn)橘皮枳術(shù)丸對(duì)功效性消化不良的治療效果優(yōu)于嗎丁啉組，P＜0.05[11]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)涉及了多門學(xué)科技術(shù)，可以從整體上揭示藥物、疾病、靶點(diǎn)之間的關(guān)系，為中醫(yī)藥治療疾病對(duì)疾病的治療提供了數(shù)據(jù)支撐，已廣泛應(yīng)用于單位中藥、中藥復(fù)方作用機(jī)制研究[12]。本研究通過對(duì)枳實(shí)、白術(shù)的有效成分檢索再篩選，共得到29種活性成分，枳實(shí)的主要活性成分有黃銅類、揮發(fā)油類、生物堿類、豆香素類。侯雪楠等人發(fā)現(xiàn)枳實(shí)的主要成分橙皮苷可以增加CUMS大鼠GR表達(dá)，抑制下丘腦促腎上腺皮質(zhì)激素釋放，改善過度亢進(jìn)的HPA軸狀態(tài)[13]。有研究證實(shí)枳實(shí)水提物可通過上調(diào)5-羥色胺受體4（5-HTR4）和神經(jīng)絲蛋白H （NF-H）的表達(dá)促進(jìn)神經(jīng)絲生長(zhǎng)， 從而顯著改善瀉劑結(jié)腸大鼠的腸道動(dòng)[14]。枳實(shí)黃酮類化合物具有良好的抗氧化作用，其中黃銅A環(huán)中5，7-二羥基為主要活性基團(tuán)，枳實(shí)黃銅能夠緩解氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的肺功能損傷，從而改善肺部組織的病理變化[15]。白術(shù)的主要活性成分有揮發(fā)性成分、內(nèi)酯類成分、苷類、多糖類成分與氨基酸類成分[16]。曹艷霞等研究發(fā)現(xiàn)白術(shù)多糖可通過調(diào)節(jié)Bcl-2蛋白、Bax蛋白的表達(dá)對(duì)應(yīng)激性胃潰瘍起到明顯的改善作用[17]。宋厚盼等觀察白術(shù)甲醇提取物可通過促進(jìn)多胺介導(dǎo)的上皮細(xì)胞遷移修復(fù)胃腸黏膜的損傷[18]。

本研究發(fā)現(xiàn)功能性消化不良與枳術(shù)丸的共同靶點(diǎn)共有23個(gè)，其中連接節(jié)點(diǎn)大于15的靶點(diǎn)有EGFR、IL6、VEGFA、CASP3；研究表明在特定的配體、組織和病理?xiàng)l件下，EGFR的配體直接激活可以產(chǎn)生不同的細(xì)胞反應(yīng)，促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和纖維化[19]。IL-6一個(gè)典型的促炎性細(xì)胞因子，有研究表明，它通過gp130的同源二聚體化激活Janus激酶（JAK）/STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與炎癥疾病有關(guān)進(jìn)程，，與胃炎的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[20]。董宏超等發(fā)現(xiàn)VEGFA可通過ERK、PI3K/Akt通路調(diào)控血管的再生與增值，與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[21]。有研究表明caspase-3是一種常見被激活的死亡蛋白酶，是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵介質(zhì)，可催化許多關(guān)鍵細(xì)胞蛋白的特異性切割[22]。

本研究GO富集分析結(jié)果表明，共同靶點(diǎn)分布于細(xì)胞的多種成分中，能夠多靶點(diǎn)、多結(jié)構(gòu)、多形式、通過多種生物進(jìn)程，包括凋亡負(fù)調(diào)控、上皮細(xì)胞增殖、氨基酸反應(yīng)等。細(xì)胞凋亡等。KEGG富集結(jié)果共得到39條信號(hào)通路，其中癌癥途徑、HIF-1信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路為關(guān)鍵信號(hào)通路，癌癥途徑與多種癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，如前列腺癌、膀胱癌、胰腺癌、子宮內(nèi)膜癌、非小細(xì)胞癌等。有研究發(fā)現(xiàn)，C-X-C基序配體8（CXCL8）是癌癥途徑中的一種關(guān)鍵因子，發(fā)揮著多功能細(xì)胞因子的作用，能以自分泌或旁分泌的方式調(diào)節(jié)腫瘤的增殖，侵襲和遷移，能參與多種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)及整合，以產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，從而介導(dǎo)各種癌癥的發(fā)生和發(fā)展[23]。缺氧誘導(dǎo)因子-1（HIF-1）是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，可在人類癌癥中低氧條件下誘導(dǎo)發(fā)生適應(yīng)性反應(yīng)，有關(guān)研究發(fā)現(xiàn)在缺氧條件下，BRU抑制了HIF-1的反式激活活性，并抑制了VEGF，GLUT1，HK2和LDHA等HIF-1靶基因的表達(dá)。此外，BRU還可以通過抑制HIF-1信號(hào)通路來降低缺氧條件下的葡萄糖消耗[24]。TNF（腫瘤壞死因子）是促炎和抗炎細(xì)胞因子，對(duì)自身免疫性疾病，癌癥的發(fā)展以及對(duì)傳染性病原體的保護(hù)至關(guān)重要。除無數(shù)其他活動(dòng)外，TNF可以是T細(xì)胞的產(chǎn)物，并可以作用于T細(xì)胞。TNF可以促進(jìn)中樞和效應(yīng)T細(xì)胞的活化和增殖，但也可以誘導(dǎo)高度活化的效應(yīng)T細(xì)胞凋亡，從而進(jìn)一步確定病原性或保護(hù)性T細(xì)胞池的大小。而且，TNF可以對(duì)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞產(chǎn)生不同的作用。它既可以下調(diào)其抑制能力，又可以在其他情況下促進(jìn)其發(fā)展或積累[25]。

綜上所述，本研究運(yùn)用了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)，揭示了枳術(shù)丸對(duì)功能性消化不良的可能的治療作用機(jī)制，但受限于數(shù)據(jù)庫、軟件的不足之處，其還可待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)論證其科學(xué)性，從而為新藥的開發(fā)提供有力依據(jù)。