SERPINE1的表達與胃癌預后及腫瘤免疫細胞浸潤的生物信息學分析

呂坤 樂奇 王軍 姜雷 姚南

研究顯示，每年有新增超過100萬的胃癌病例，為世界上第五大最常見的癌癥，也是繼肺癌和結直腸癌之后的第三大癌癥死亡原因，而且在亞洲的發病率明顯高于其他地區[1,2]。腫瘤復發和轉移是其預后不良的重要因素，而免疫相關機制參與了腫瘤的發生、發展、轉移和復發[3,4]；而免疫治療在臨床上已被廣泛使用[5]。已有的研究報道了免疫治療在許多晚期實體瘤中的顯著療效[6]。在轉移性或復發性胃癌患者中，幾乎所有MSI-H亞型的胃癌患者接受了帕博利珠單抗的治療后有顯著療效[7]。細胞毒性T淋巴細胞相關抗原4(CTLA4)、程序性死亡1(PD-1)和程序性死亡配體1(PD-L1)抑制劑在治療轉移性黑色素瘤、非小細胞肺癌和腎細胞癌方面顯示出更明顯的抗腫瘤效果[7-9]。然而，抗CTLA4、抗PD-1和抗PD-L1治療晚期胃癌的臨床療效并不顯著。腫瘤細胞的免疫反應主要由CD8陽性細胞毒性T細胞誘導，導致一系列的階梯式和級聯式反應(所謂的癌癥免疫循環)，一些受體及其配體促進或抑制癌癥免疫循環的每個步驟[10]。免疫治療的療效似乎與腫瘤的免疫微環境和免疫反應的表現有關，臨床試驗證明，腫瘤微環境中的各類免疫細胞和基質細胞在腫瘤化療和免疫治療的臨床療效和疾病預后中具有明顯的相關性[4,11]。因此，深入了解胃癌的發病機制和免疫相關機制，找到更敏感的免疫治療靶點至關重要。

1 材料與方法

1.1 TCGA數據庫分析 為了探索SERPINE1作為胃腸道腫瘤預后生物標志物的潛力，我們使用癌癥基因組圖譜(TCGA)RNA-seq數據集[12]下載了胃癌的臨床信息數據，并對轉錄組分析數據進行處理，對所有數據進行對數轉換。缺少隨訪數據的樣本被排除。使用Strawberry Perl(5.32.1版)軟件將原始轉錄組數據整理成基因表達矩陣文件。最后，使用 “limma[13]”、“beeswarm”和“ggpubr”將數據可視化。R軟件(版本4.0.3)軟件包來可視化和分析數據。

1.2 PrognoScan數據庫分析 利用PrognoScan數據庫搜索SERPINE1的表達水平，確定其與預后的關系，包括總生存期(OS)和無病生存期(DFS)[14]。

1.3 Kaplan-Meier plotter分析 Kaplan-Meier plotter是利用從GEO、EGA和TCGA數據庫下載的癌癥患者的基因表達數據和生存信息創建的在線數據庫。它有效地提供了21種癌癥的54 k個基因(mRNA、miRNA、蛋白質)的生存影響[15]。我們使用Kaplan-Meier plotter數據庫來研究SERPINE1 mRNA在胃癌患者中的臨床預后意義。采用Kaplan-Meier單變量和Cox多因素生存分析法來分析SERPINE1表達與生存的相關性。最后，利用R軟件(4.0.3版)對Kaplan-Meier繪圖儀中的胃癌OS(總生存期)和PFS(無進展生存期)的相關預后信息進行了直觀分析。

1.4 TIMER數據庫分析 TIMER是一個在線數據庫，研究惡性腫瘤細胞和宿主免疫系統之間的相互作用，并闡明復雜的腫瘤-免疫相互作用，包括來自TCGA的32種癌癥的10 897個樣本，用以估計免疫浸潤的程度[15]。我們通過基因模塊分析了SERPINE1與B細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞、中性粒細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞浸潤程度之間的關系。我們進一步進行Kaplan-Meier曲線分析，探討基因表達或免疫細胞浸潤對患者生存的影響。

1.5 GEPIA數據庫分析 GEPIA是一個在線數據庫，包含了來自TCGA和GTEx的9 736個腫瘤和8 587個正常樣本的RNA測序表達數據，可用于基因表達譜的交互分析[16]。我們使用GEPIA來評估SERPINE1的表達與腫瘤免疫細胞浸潤相關的特定標記物的表達之間的關聯，并驗證SERPINE1在胃癌中的表達與其較差的預后之間的聯系。

1.6 GSEA基因組富集分析 使用MSigDB的C7.all.v.7.4symbols.gmt作為目標集，使用從Broad Institute下載的GSEA軟件(4.1.0版)分析所有腫瘤病例。使用了默認的加權富集統計方法。隨機組合的數量被設置為1 000，其他參數被設置為默認值。只有NOMP<0.05的基因組被認為是具有統計學意義的明顯富集的基因組。

1.7 統計學分析 從TCGA獲得RNA-seq數據集，并對所有數據進行了Log2轉換，GEPIA和Kaplan-Meier繪圖儀使用對數rank檢驗來計算HR和其P值來比較生存曲線，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 利用TCGA和TIMER數據庫分析SERPINE1在不同腫瘤和正常組織中的表達。

2.1.1 利用TCGA和TIMER數據庫來評估SERPINE1在33種腫瘤類型中的差異。在TIMER數據庫中下載SERPINE1在33種腫瘤類型中表達圖片，結果發現，SERPINE1在乳腺浸潤性癌、結腸腺癌、食道癌、頭頸部鱗狀細胞癌中呈差異表達。腎臟透明細胞癌，直腸腺癌，胃腺癌，甲狀腺癌的表達明顯高于正常對照組。在腎嫌色細胞癌、腎臟腎乳頭狀細胞癌、肝臟肝細胞癌、子宮內膜癌組織中，SERPINE1的表達量明顯低于正常對照。見圖1。

圖1 SERPINE1在不同類型的人類癌癥中的表達水平

2.1.2 從TCGA數據庫中下載了胃癌的轉錄組分析數據和臨床信息數據其中包括375個腫瘤組織和32個正常組織，并分析了SERPINE1在胃癌組織和正常組織中的表達，結果顯示SERPINE1在胃癌中的表達明顯高于正常組織(P<0.001)。見圖2。

圖2 TCGA數據庫中SERPINE1在正常和癌組織樣本中的表達

2.2 胃癌中SERPINE1的高表達與胃癌的浸潤深度有關并影響預后 我們從TIMER數據庫發現，SERPINE1的表達與胃癌患者的預后不良有關。然后我們進一步利用Kaplan-Meier plotter數據庫來評估SERPINE1表達與胃癌患者臨床病理之間的關系，以探索其潛在機制。其中，胃癌患者的總生存期和無進展生存期與性別、T期、M期和SERPINE1高表達明顯相關。此外，SERPINE1 mRNA的高表達與胃癌3至4期患者的OS和PFS惡化有關，但與2期(OSHR=1.58，P=0.14；PFSHR=1.82，P=0.083)和N3期患者(OSHR=1.58，P=0.097；PFSHR=1.55，P=0.11)無關 。此外，在四個T分類中，SERPINE1高表達在T4的總生存期和無進展生存期中具有最高的HR，表明SERPINE1的表達水平可以影響胃癌患者T分期，從而影響患者的預后。見圖3。

圖3 SERPINE1的表達與胃癌臨床參數的關系；SERPINE1與病理參數的單變量和多變量Cox分析

2.3 SERPINE1的表達與免疫浸潤的關系 胃癌通常表現為廣泛的局部腫瘤浸潤，并經常擴散到轉移部位，特別是淋巴結。惡性腫瘤的擴散是一個多步驟的過程，腫瘤入侵的許多階段需要降解或破壞腫瘤細胞周圍的細胞外基質和結締組織[17]。而淋巴細胞滲入腫瘤的頻率不僅可以獨立預測淋巴結轉移，還能影響患者的預后[18]。因此，我們利用TIMER數據庫[15]研究了33種癌癥類型中SERPINE1的表達是否與免疫浸潤的水平相關。結果顯示，SERPINE1在26種癌癥中的表達與腫瘤純度(腫瘤組織中腫瘤細胞所占比例)明顯相關，在18種癌癥中與B細胞浸潤水平相關。此外，SERPINE1的表達與28種癌癥的CD8+T細胞、18種癌癥的CD4+T細胞、27種癌癥的巨噬細胞、30種癌癥的中性粒細胞和30種癌癥的樹突狀細胞的浸潤水平明顯相關。

2.4 探討SERPINE1表達與免疫標志物的相關性，驗證SERPINE1表達在胃癌臨床預后中的價值 腫瘤微環境(TME)由多種細胞類型組成，包括血管、免疫細胞、基質細胞和細胞外基質，它們對腫瘤的發生、發展至關重要，并參與了腫瘤的免疫逃逸機制[19]。因此，為了進一步了解SERPINE1與不同浸潤免疫細胞類型之間的關系，我們利用GEPIA數據庫[16]分析了SERPINE1與各免疫細胞類型的特征基因之間的相關性，從而分析SERPINE1通過調節免疫細胞改變TME，導致腫瘤的發生、發展以及免疫逃逸機制的發展的表達水平。利用GEPIA數據庫進一步驗證SERPINE1在STAD中的表達與這些標志物之間的關系，發現SERPINE1與Treg、T細胞耗竭、單核細胞、TAMS和M2巨噬細胞的標志物之間的相關性與TIMER數據庫相似。SERPINE1與樹突狀細胞對腫瘤的侵襲密切相關。DC能夠通過增強Treg反應和抑制CD8+T細胞的殺傷力來提高腫瘤轉移的水平[20].從而證實了SERPINE1與STAD免疫浸潤細胞的特異性關聯，表明SERPINE1在胃癌TME的免疫逃逸中具有重要作用。此外，我們通過GEPIA數據庫發現，SERPINE1的表達與胃癌較差的總生存期(P=4.8e-05)和無病生存期(P=0.005)明顯相關。見圖4，表1。

圖4 GEPIA在線數據庫的胃腺癌(STAD)總生存期和無病生存期的Kaplan-Meier圖

表1 SERPINE1在胃癌中表達與GEPIA數據庫中的單核細胞、TAM、M2巨噬細胞、調節性T細胞和T細胞耗竭的標志物之間的相關性分析

2.5 基因組的富集度分析 我們從TCGA數據庫下載胃癌轉錄組分析數據和臨床信息數據，用GESA做KEGG信號通路富集分析。KEGG分析從上至下，從左至右依次顯示為：趨化因子信號通路，細胞粘附分子，補體和凝血級聯，ERBB信號通路，FC γ R介導的吞噬作用，白細胞跨內皮遷移，造血細胞系，自然殺傷細胞介導的細胞毒性。核苷酸結合寡聚域(NOD)類受體信號通路、Toll類受體信號通路、mTOR信號通路和T細胞受體信號通路是腫瘤免疫相關基因交叉富集的主要途徑；其中淡綠色曲線表示富集度分數概況，灰色區域表示指標排名分值。見圖5。

圖5 GSEA分析結果，篩選出高免疫分數組和低免疫分數組之間的重要通路;GSEA，基因集富集分析;“H”，正相關;“L”，負相關

3 討論

近年來，在胃癌的生物學以及手術和免疫治療方面取得了很大進展，但由于缺乏胃癌的早期診斷方法和有效的生物標志物，導致大部分胃癌患者進展到中晚期，導致預后不良，是人類面臨的一大威脅[20]。因此，尋找新的免疫相關療法來治療胃癌，是研究人員改善患者預后、延長患者生存時間的迫切需求。

SERPINE1，也被稱為血漿蛋白原激活劑抑制劑1(PAI-1)，是絲氨酸蛋白酶抑制劑(SERPIN)家族的重要成員。SERPINE1是尿激酶和組織蛋白酶原激活劑(uPA和tPA)的一個主要抑制劑。過去的研究集中在SERPINE1對血栓形成的影響。然而，SERPINE1在各種類型的癌癥中的作用已成為一個研究熱點。凝血酶原激活劑系統在細胞外基質重塑中起著關鍵作用，這與腫瘤的進展和轉移密切相關[21,22]。大量研究表明，SERPINE1具有促血管生成作用、抗凋亡作用[23,24]，還能誘導腫瘤血管化，激活炎癥反應[25,26]。此外，SERPINE1受多種信號的調控，主要是生長因子和細胞因子以及激素和環境壓力，如缺氧，而這些信號大多是促進腫瘤的因素[27]。這些都有力地表明，SERPINE1可能在腫瘤的發生、發展、轉移和侵襲中起著關鍵作用。SERPINE1的高表達也是對化療不敏感的一個腫瘤預后不良的因素[28,29]，越來越多的研究報道SERPINE1在多種癌癥中過表達，如胃癌[30]，食道癌[31]，頭頸癌[32]，非小細胞肺癌[33]，和惡性黑色素瘤[34]，提示SERPINE1的表達與臨床預后有關。然而，SERPINE1在與免疫浸潤相關的機制中的作用目前還不清楚。因此，我們在此研究SERPINE1表達水平的變化與胃癌預后相關，尤其是SERPINE1的高表達與胃癌預后不良密切相關。SERPINE1表達水平的升高可以影響胃癌的浸潤程度，從而影響患者的預后，這表明SERPINE1的表達可以作為腫瘤轉移的預測指標。此外，我們的分析顯示，免疫浸潤的程度和不同的免疫標記物組與胃癌的SERPINE1表達水平相關。因此，我們的發現有助于將SERPINE1作為胃癌的預后潛在生物標志物，并將對這種潛力的理解擴展到臨床其他相關的亞型。

免疫細胞在TME中的浸潤不僅可以影響腫瘤細胞的生存、轉移和侵襲，還可能與免疫治療過程中的治療耐藥性密切相關[31,32,35,36]。而我們發現SERPINE1的表達與胃癌中不同類型的免疫細胞的浸潤水平相關：SERPINE1的表達水平與CD8+T細胞和B細胞的浸潤水平呈弱正相關，與巨噬細胞、自然殺傷細胞和DC細胞呈明顯正相關。SERPINE1的表達與免疫細胞標志物的相關性表明，SERPINE1對STAD的抗腫瘤免疫有調節作用。

而后，通過對KEGG信號通路的富集分析，我們發現自然殺傷細胞介導的細胞毒性信號通路是調節免疫環境的重要通路，在調節腫瘤免疫過程中發揮著重要作用[37]。自然殺傷細胞(NK-cell)，是一種對先天免疫系統至關重要的細胞毒性淋巴細胞。NK細胞對病毒感染的細胞有反應，對腫瘤的形成也有反應，在沒有抗體和MHC的情況下，識別受壓細胞的能力可以使免疫反應更快，也可以破壞不能被其他免疫細胞檢測和破壞的細胞[38]。 此外，NK細胞分泌一些細胞因子、趨化因子和生長因子，如IFN-γ、TNF-α、轉化生長因子β(TGF-β)、巨噬細胞炎癥蛋白-1β(MIP-1β)、RANTES和粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)增強抗腫瘤免疫力，它們還表現出記憶樣細胞特征[39]。然而，最近有研究表明，惡性腫瘤由于腫瘤微環境中低濃度的葡萄糖、高濃度的乳酸和低pH值引起的細胞代謝受損，從而導致NK細胞功能紊亂使NK細胞的抗腫瘤反應受損[40,41]。因此，進一步了解SERPINE1與自然殺傷細胞介導的細胞毒性信號通路之間的聯系可能在胃癌的免疫治療方面有更大的突破。

綜上所述，我們通過研究發現，SERPINE1的表達與胃癌患者的總體生存和預后、多種類型的免疫浸潤和免疫過程有關。該基因可被視為判斷預后的生物標志物，也可作為胃癌治療的標志物，這可能是胃癌免疫治療的一個重點。與其他類似的研究一樣，本研究的主要數據來自于生物信息學，所以本研究的證據仍然是間接的。對SERPINE1的進一步研究可能會對腫瘤微環境與胃癌免疫治療和預后之間的潛在關系帶來新的啟示。